香菇酱油制曲工艺的优化

赵杨杨，于贞

(烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005)

香菇又名香蕈、香信，栽培历史悠久，最早的剁花种菇法距今已经有 800 多年[1]。香菇是最常见的一种可食用真菌，其含有丰富的呈味氨基酸和核苷酸,赋予了香菇独特的鲜味[2]， 在日常烹调中它也可以替代味精,在菜肴中起到提鲜的作用。香菇中还含有香菇多糖[3]、嘌呤[4]、多酚[5]等生物活性物质，因此香菇具有一定的抗肿瘤[6-7]、抗氧化[8-9]、降血脂[10]等生理功能。

酱油是烹饪中不可缺少的一类调味品，最初人们对酱油的要求为满足简单调味、上色即可，但随着生活水平的提高以及消费观念的转变，人们更加注重酱油口感和营养价值的丰富性[11]。这使得酱油向功能型酱油的方向发展，因此众多提高酱油营养价值的功能型酱油面向市场。香菇味道鲜美，营养价值丰富，利用香菇进行酱油的酿造不仅使酱油具备了香菇的浓郁鲜味，而且增加了酱油的生物活性成分，为人们提供了更高质量、更美味的酱油产品[12]。目前市售的大部分香菇酱油都是以香菇提取液为原料，加入到酱油中调配而成的。此方法虽然对提高酱油鲜味有所帮助，但并不能使香菇中营养物质和鲜味物质完全降解，充分溶解到酱油中，对于酱油品质没有很大的改观。只有经过微生物的降解以及各种化学反应共同作用而酿造出的原酿酱油才称得上是高品质的香菇酱油。为了得到一种高品质的香菇酱油，本试验以豆粕、小麦、烘干粉碎的香菇为原料制备香菇酱油成曲，通过单因素试验研究成曲润水量、接种量、香菇添加量和制曲时间4个因素对香菇酱油成曲中性蛋白酶活性的影响，通过正交试验优化香菇酱油制曲工艺，以期为香菇酱油的发酵生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株：米曲霉AS3.042，烟台大学生物工程实验室保藏。

试验原料：豆粕、小麦粉(均由山东鲁花生物科技有限公司提供)、香菇(购自烟台大学市场)。

1.2 主要试验仪器

DHP-9162电热恒温培养箱、DHG-9140A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；D-1自动控制压力蒸汽灭菌锅 北京发恩科贸有限公司；MQD-B3R全温振荡培养箱 上海旻泉仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州智博瑞仪器制造有限公司；TDL-5-A低速台式大容量离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 主要试剂

酪氨酸、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、氢氧化钠、干酪素、盐酸：均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；福林酚：分析纯，上海源叶生物科技有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 成曲的制备

将豆粕用热水润湿至无硬心后，与小麦颗粒按1∶1(质量比)的比例混合，加入烘干粉碎的香菇，0.1 MPa，121 ℃，高压蒸汽灭菌20 min。接入香菇粉驯化后的米曲霉AS3.042，置于30 ℃恒温培养箱中培养一段时间，待曲料升温结块时进行翻曲。

1.4.2 样品粗酶液的制备

取一定量的样品，进行充分研磨，准确称取1.000 g样品，加入pH 7.5的磷酸盐缓冲液，定容至100 mL,置于40 ℃恒温水浴锅中浸提1 h，期间摇匀3次。浸提完毕后，以5 000 r/min离心20 min得到粗酶液。此过程中需要测定中性蛋白酶酶活和曲料的水分含量。

1.4.3 分析检测

中性蛋白酶酶活的测定：参考SB/T 10317-1999 《蛋白酶活力测定法》；曲料水分含量的测定：参考GB 5009.3-2016 《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。

1.4.4 制曲工艺优化单因素试验

1.4.4.1 润水量的确定

在30 ℃下，分别将成曲的润水量设定为46%、50%、54%、58%、62%(质量比)，香菇添加量为5%(质量比)，接种量为0.8×106个/g，培养42 h后测定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.2 接种量的确定

确定润水量后，以最佳润水量进行润水制曲。在30 ℃下，分别将成曲的接种量设定为0.4×106，0.6×106，0.8×106，1.0×106，1.2×106个/g，香菇添加量为5%(质量比)，培养42 h后测定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.3 香菇添加量的确定

确定润水量和接种量后，在30 ℃下，分别将成曲中香菇添加量设定为1%、3%、5%、7%、9%(质量比)，培养42 h后测定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.4 成曲制曲时间的确定

以最佳润水量、接种量和香菇添加量进行制曲，发酵温度不变。分别在30，42，54，66，78 h取样，测定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.5 制曲工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，分别以润水量(A)、接种量(B)、香菇添加量(C)、制曲时间(D)4个因素为自变量，以中性蛋白酶酶活为响应值(Y)，根据正交试验确定制曲工艺的最佳条件，正交试验因素水平见表1。

表1 制曲工艺优化正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of koji-making technology

1.5 数据处理

采用Excel进行数据统计与绘图处理，SPSS 26.0进行单因素方差分析，所有测定重复3次取平均值。

2 结果与讨论

2.1 制曲工艺单因素试验

2.1.1 润水量对成曲中性蛋白酶活性的影响

水分既是使原料充分溶解的重要保证，又是维持米曲霉正常生长和代谢的必要条件。当曲料中含水量适当时，曲料吸水膨胀，营养物质溶出，为米曲霉的生长提供养料，从而加速米曲霉的生长。因此，在制曲过程中应该使曲料的水分活度保持在0.9左右，曲室相对湿度保持在90%左右，这样才能保证米曲霉的最佳生长环境[13]。但润水量也不宜过高，否则会造成曲料结块、曲温升高，反而容易增加染菌的风险，会形成酸曲、花曲，造成曲的质量下降[14]。成曲润水量对酱油成曲中性蛋白酶活性的影响见图1。

图1 成曲中润水量对中性蛋白酶酶活的影响Fig.1 Effect of moistening water amount in finished koji on the activity of neutral protease

由图1可知，润水量在54%时，成曲的中性蛋白酶活性最高，为1 423.62 U/g干曲，当润水量高于54%时，成曲的中性蛋白酶活性逐渐降低。在制曲过程中，充足的水分使原料经高温蒸煮变性糊化，从而更有利于米曲霉对原料的充分利用，同时为米曲霉的生长和维持代谢提供了充足的水分。润水量过低，无法提供米曲霉生长所需要的水分，导致米曲霉生长速度缓慢。而当润水量过高时，酶活降低，也验证了上述的观点，曲料容易结块，部分曲温变高，有利于其他杂菌的生长，使原料被杂菌利用降解，产生了难闻的气味，从而影响了米曲霉的生长[15]。

2.1.2 米曲霉接种量对成曲中性蛋白酶活性的影响

米曲霉孢子从发芽生长至成熟期产酶能力不断增强，但米曲霉的生长形态不是统一的，只有充足的接种量才能保证在一定的发酵时间内有大量的米曲霉达到成熟期，进而使成曲酶活达到最高值[16]。接种量对酱油成曲中性蛋白酶活性的影响见图2。

图2 成曲中接种量对中性蛋白酶酶活的影响Fig.2 Effect of inoculation amount in finished koji on the activity of neutral protease

由图2可知，当米曲霉接种量为0.6×106个/g时，成曲的中性蛋白酶活性最高，达到2 655.52 U/g干曲，当高于此接种量时，成曲的中性蛋白酶活性逐渐降低。米曲霉接种量过低时酶活不高,这是因为虽然米曲霉生长达到成熟期，但是米曲霉生物量低，所以产生的酶的总量低；米曲霉接种量过高，成曲酶活降低，这可能是由于米曲霉菌丝大量繁殖，但是测定时大多数菌丝还没有达到成熟期，所以产生的蛋白酶减少。但也有可能是因为接种量过高，米曲霉生长耗氧量急剧增加，导致培养基中的氧气量不足，而米曲霉是好氧微生物，因此对米曲霉的生长产生了影响，最终导致米曲霉产酶能力不强[17]。

2.1.3 香菇添加量对成曲中性蛋白酶活性的影响

米曲霉的生长主要靠豆粕和小麦提供氮源和碳源，而香菇的营养价值极其丰富，也可以为米曲霉的生长提供营养条件。但据报道，通过水和有机溶剂提取获得的香菇提取物能够抑制微生物的生长，因此香菇的添加量不宜过高，否则会对米曲霉的生长起到抑制作用[18]。香菇添加量对成曲中性蛋白酶活性的影响见图3。

图3 成曲中香菇添加量对中性蛋白酶酶活的影响Fig.3 Effect of addition amount of Lentinus edodes in finished koji on the activity of neutral protease

由图3可知，添加1%～5%(质量比)的香菇，成曲的中性蛋白酶活性逐渐升高，香菇添加量为5%(质量比)时，成曲的中性蛋白酶活性最高，达到3 348.30 U/g干曲，但香菇添加量高于5%(质量比)时，成曲的中性蛋白酶活性逐渐降低。香菇中含有丰富的蛋白质、多糖等营养物质，添加适量的香菇可以为米曲霉的生长提供充分的能量，有利于提高成曲的中性蛋白酶活性；但当香菇添加量过高时，香菇中的一些抗菌类物质比如多酚、黄酮类物质[19]，可能会抑制米曲霉的生长，从而影响酶系的分泌，最终导致成曲的中性蛋白酶活性不高。

2.1.4 制曲时间对成曲中性蛋白酶活性的影响

米曲霉从孢子发芽生长到成熟期需要一定的时间，这样才能够保证米曲霉达到最发达的酶系。但在实际生产过程中，从经济成本角度出发，制曲时间不宜过长，并且米曲霉生产代谢产物的堆积也会对成曲酶活造成一定的影响[20]。制曲时间对成曲中性蛋白酶活性的影响见图4。

图4 制曲时间对中性蛋白酶酶活的影响Fig.4 Effect of koji-making time on the activuty of neutral protease

由图4可知，当制曲时间在36～66 h时，成曲的中性蛋白酶活性逐渐升高，当制曲时间为66 h时，成曲中性蛋白酶活性最高，达到3 170.20 U/g干曲，当制曲时间超过66 h时，中性蛋白酶活性急剧降低。66 h之前，米曲霉不断生长繁殖，代谢分泌旺盛，因此中性蛋白酶活性不断提高；制曲66 h时，米曲霉的生长达到成熟期，成曲的蛋白酶活性达到最大值；但当制曲时间超过66 h时，米曲霉生长代谢产物的堆积可能对成曲酶活造成一定的影响。据报道，米曲霉在生长过程中糖代谢链会产生曲酸，并且随着发酵的进行，曲酸产量会逐渐增加，而曲酸是良好的酪氨酸酶抑制剂，仅20 μg/mL 就可以抑制80%的酪氨酸酶活力[21-22]。因此如果制曲时间过长，米曲霉的代谢产物曲酸可能会对成曲的酶活产生抑制作用。

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，以润水量(A)、米曲霉接种量(B)、香菇添加量(C)、制曲时间(D)为自变量，以中性蛋白酶活性为响应值，进行正交试验优化制曲工艺，结果见表2。各因素对中性蛋白酶酶活的方差分析结果见表3。

表2 制曲优化工艺正交试验设计与结果Table 2 Design and results of orthogonal test for optimization of koji-making technology

续 表

表3 各因素对中性蛋白酶酶活的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of various factors on the activity of neutral protease

由表2可知，4个因素对酶活性的影响依次为B>C>D>A，最优组合为A2B3C1D1，即当成曲润水量为54%(质量比)，米曲霉接种量为0.8×106个/g，香菇添加量为3%(质量比)，制曲时间为54 h时，成曲中性蛋白酶活性最高。由表3可知，米曲霉接种量对成曲中性蛋白酶活性的影响极其显著，香菇添加量对成曲中性蛋白酶活性的影响较为显著，而成曲润水量和制曲时间对成曲中性蛋白酶活性的影响不显著。

2.3 结果验证

以最优组合进行发酵，即成曲润水量为54%(质量比)、米曲霉接种量为0.8×106个/g，香菇添加量为3%(质量比)，制曲时间为54 h，发酵后测定成曲中性蛋白酶活性为4 414.31 U/g干曲，均高于正交试验组合中的中性蛋白酶活性。

3 小结

将香菇与普通成曲混合来优化制曲工艺，有利于提高成曲的中性蛋白酶活性，这是原料中的蛋白质被充分降解、提高香菇酱油氨态氮含量的前提。对成曲中性蛋白酶活性影响的因素从大到小依次为米曲霉接种量>香菇添加量>制曲时间>润水量。香菇酱油制曲工艺最佳条件为米曲霉接种量0.8×106个/g、香菇添加量3%(质量比)、制曲时间54 h、成曲润水量54%(质量比)。在此优化条件下发酵的香菇酱油成曲的中性蛋白酶酶活可达4 414.31 U/g干曲。