δ-葡萄糖酸内酯添加量对豆腐凝胶特性的影响

杨雅婧，张志衡，琚魏波，李玉娥，陈振家

(山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801)

大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)，豆科大豆属，在全世界范围内均有种植。大豆中有35%～40%的蛋白质，是良好的蛋白质来源之一，脂类约占20%，还含有约9%的膳食纤维[1]。已证明大豆中的蛋白质、异黄酮、皂甙和蛋白酶抑制剂等生物活性物质在调节人体生理功能和预防慢性疾病方面起着重要作用[2]。豆腐作为一种传统豆制品，由于其热量较低而在全球范围内广受欢迎。研究表明，豆腐可以潜在地降低心血管疾病、高血压、糖尿病和其他疾病的风险[3]。随着豆腐形成理论的确认和现代食品加工技术的发展，豆腐产品的多样性满足了不同的消费需求。

豆腐的生产过程中点浆是最关键的一步，即在豆浆中添加不同的凝固剂使其发生凝固[4]。内酯豆腐是加入GDL这种酸类凝固剂形成的，GDL在豆浆中溶解，释放出葡萄糖酸，由于H+释放速率相对缓慢，蛋白质表面的静电斥力减弱，蛋白质网络结构形成缓慢，有助于形成细腻均匀的结构[5]，因此制作出的内酯豆腐爽口滑嫩、质地细腻，深受消费者喜爱。

然而长期以来，我国内酯豆腐生产企业大多生产模式较粗放，凝固剂的用量依靠经验确定，这些因素会导致内酯豆腐品质极不稳定，无法进行标准化生产。基于此，通过对不同GDL添加量形成的内酯豆腐品质进行检测与分析，研究GDL添加量与内酯豆腐凝胶特性的相关性，以期为豆制品的工业化生产提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 材料

市售大豆样品：绥化市正大米业有限公司；市售δ-葡萄糖酸内酯：安琪酵母股份有限公司。

1.2 试剂

考马斯亮蓝G-250、SDS、β-巯基乙醇、溴酚蓝、低分子量蛋白质Marker(14.4～97.4 ku)、Tris：北京索莱宝科技有限公司；甲叉双丙烯酰胺、无水乙醇、甘氨酸、甘油：生工生物工程(上海)股份有限公司；氯化钠、尿素、盐酸、罗丹明：国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯，均用普通蒸馏水配制。

1.3 主要仪器与设备

九阳JYL-G12E型榨汁搅拌机；华帝TLSK-22GB01型电陶炉；HH型数显恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限公司；TMS-Pro型质构仪 Food Technology Corporation；TCS SP8型激光扫描共聚焦显微镜 德国徕卡(Leia)仪器公司；HC-2064型高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-1200型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；DYY-7C型电泳仪 北京六一仪器厂；Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克(Bruker)公司。

1.4 方法

1.4.1 内酯豆腐的制备

大豆浸泡12 h，按1∶5的比例与水磨浆，过200目筛，取豆浆煮沸5 min[6]，冷却至85 ℃，在豆浆pH为6.5的条件下分别按照豆浆0.2%、0.3%、0.4%的比例添加GDL，于85 ℃水浴锅中恒温1 h取出。

1.4.2 内酯豆腐质构性的测定

将豆腐切成长方体(4 cm×4 cm×1 cm)，采用质构仪测定[7]，重复10次。

1.4.3 内酯豆腐含水量及保水性的测定

含水量(MC)参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法[8]进行测定。

参考王睿粲[9]的方法。离心管内管底部为网状，放一张滤纸于内管中，记滤纸和内管的质量为m1，称取豆腐约1 g于内管中，记此时内管质量为m2，离心管在3 500 r/min下离心10 min后，记内管质量为m3，其保水性通过下式计算：

1.4.4 内酯豆腐凝胶作用力的测定

参考Gómez-Guillén等[10]的方法。采用考马斯亮蓝法测定。

1.4.5 SDS-PAGE

参考Lars等[11]的方法。称取5 mg固体样品加入处理液中，液体样品的蛋白浓度为1 mg/mL，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，上样量为6 μL。

1.4.6 傅里叶变换红外光谱分析

参照Shin等[12]的方法。将冻干样品与KBr按1∶100研磨，压成透明片状后测定，利用PeakFit软件计算二级结构的相对含量。

1.4.7 内酯豆腐微观结构的测定

参考Kuipers等[13]的方法。将1 mL 0.2%罗丹明溶液加入100 mL豆乳中，分别配制0.2%、0.3%、0.4% GDL添加量的混合溶液，振荡均匀后取10 μL滴在载玻片上，盖上盖玻片，并滴加少量指甲油防止水分蒸发，包裹锡纸，在90 ℃保温箱中保温1 h，冷却至室温，避光放置，通过激光共聚焦显微镜进行观察，激发波长设置为543 nm，测定范围为580～700 nm。

1.4.8 数据处理

利用Origin 8.0和Excel软件统计分析数据并作图，用SPSS软件分析不同处理间的差异性，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 GDL添加量对豆腐质构性的影响

质构性是评价豆腐感官特性的重要指标之一，在测定过程中，模拟施加的食物在口腔中的咀嚼过程，选取以下4个参数：硬度、内聚性、弹性和咀嚼性[14]。由表1可知，随着GDL添加量的增加，内酯豆腐的弹性、硬度和咀嚼性均呈上升趋势，内聚性先降低后升高。表明随着GDL添加量的增加，H+释放增多，进一步降低豆浆水溶性蛋白体系的pH值，使大豆蛋白H+电离程度降低，进而削弱大豆蛋白的水合能力，促使大豆蛋白失去水化膜而发生聚集[15]。GDL添加量的增加也导致更多的蛋白质参与豆腐凝胶的形成，进而形成更加完善的凝胶三维网络结构，这是导致内酯豆腐的硬度、弹性和咀嚼性增加的原因[16]。

表1 GDL添加量对豆腐质构性的影响Table 1 Effect of GDL addition amount on the texture properties of tofu

2.2 GDL添加量对豆腐含水量与保水性的影响

含水量指食物中水分所占比例；保水性指蛋白质保留住水分的能力，随着豆腐保水性的增加，其得率也增加，豆腐品质得到提升[17]。由图1可知，内酯豆腐的含水量很高，均在90%左右，当GDL添加量为0.2%时含水量最高，达到91.78%，随着GDL添加量的增加，含水量逐渐降低；GDL添加量对豆腐保水性的影响很大，内酯豆腐的保水性随着GDL添加量的增加呈逐渐上升趋势，0.4%内酯豆腐的保水性最高，达到83.38%。

图1 GDL添加量对豆腐含水量和保水性的影响Fig.1 Effect of GDL addition amount on water content and water retention of tofu

GDL添加量的增加会促进豆浆中蛋白质的聚集，而聚集程度的增加会加速豆腐凝胶网络形成的速率，导致部分水分从凝胶网络中析出[18]。因此，随着GDL添加量的增加，内酯豆腐的含水量逐渐降低，此外，GDL添加量会促进更多蛋白质参与凝胶形成和凝胶网络的充分形成，加大对凝胶网络内部水分的束缚，进而内酯豆腐的保水性随着GDL添加量的增加呈逐渐上升趋势[19]。

2.3 GDL添加量对豆腐凝胶作用力的影响

在豆腐制备过程中大豆蛋白的凝胶化过程较为复杂，包括通过热变性暴露疏水基团，通过蛋白质缔合聚集，以及通过疏水和电荷相互作用凝结，形成三维网状结构[20]。内酯豆腐中维持凝胶结构的分子间作用力主要包括氢键、离子键、疏水相互作用和二硫键，这些作用力使得凝胶达到平衡状态[21]。由图2可知，0.2%内酯豆腐的凝胶作用力贡献大小排序为：疏水作用>二硫键>氢键>离子键，0.3%内酯豆腐的凝胶作用力贡献大小排序为：疏水作用>二硫键>离子键>氢键，0.4%内酯豆腐的凝胶作用力贡献大小排序为：疏水作用>氢键>二硫键>离子键，随着GDL添加量的增加，内酯豆腐的疏水作用有一定增加，离子键和二硫键先增加后减少，而氢键则先减少后增加，由于豆浆中的蛋白质全部参与了内酯豆腐凝胶结构的形成，因此作用力的测定结果说明，增加GDL添加量后，更多的蛋白质通过疏水作用结合到凝胶网络结构中，改变了内酯豆腐中凝胶作用力的比例。

图2 GDL添加量对豆腐中凝胶作用力组成的影响Fig.2 Effect of GDL addition amount on gel force composition of tofu

在豆腐形成过程中，大豆蛋白在豆浆煮制过程中已经得到充分变性，变性后的蛋白疏水基团充分暴露，此时豆浆中蛋白已经具备足够的聚集趋势，但蛋白与水分之间的水合状态在氢键作用下得以保持[22]。而随着内酯的添加，在改变pH值的同时，破坏蛋白质的水合状态，引发蛋白聚集。因此，GDL的添加促进更多的蛋白质通过疏水作用力形成并构建凝胶三维网络结构[23]。

2.4 SDS-PAGE

由图3中a可知，内酯豆腐中的亚基组成主要包括11S的A、B亚基和7S的α、α′、β亚基，以及部分大分子聚集体(>100 ku)，豆腐中可溶性蛋白含量很少且主要由11S亚基组成，不溶性蛋白主要由7S亚基组成，且随着GDL添加量的增加，可溶性蛋白的亚基条带逐渐减少，说明蛋白质向凝胶转化的趋势增大；由图3中b可知，内酯豆腐在SA、SB、SC、SD 4种溶液中的亚基条带逐渐增加，尤其以SC、SD溶液中的变化最为明显，说明疏水作用是内酯豆腐中主要作用力，而离子键和氢键在豆腐中的占比较少，SA、SB、SC溶液中以11S的A亚基条带为主，说明离子键和氢键主要参与了11S凝胶网络的形成，SD中7S条带大幅增加，11S亚基条带也有所加深，说明疏水作用主要参与7S凝胶的形成，同时对11S凝胶的形成也有一定的贡献，增加GDL添加量后，SB、SC溶液7S亚基逐渐消失，离子键和氢键的占比降低；对比图3中a、c和b、d发现，加入β-巯基乙醇后，电泳图中出现了新的亚基(A3)，11S的B亚基条带明显加深，且大分子聚集体条带变浅，说明内酯豆腐中的部分11S和大分子聚集体通过二硫键结合。

a

b

c

d

2.5 红外光谱测定结果

大豆蛋白质凝胶体系与其二级结构密切相关，通过傅里叶变换红外光谱对豆腐中蛋白质的二级结构进行测定，能够反映出GDL添加量对豆腐中蛋白质聚集状态的影响[24]。红外光谱图上不同波峰对应不同的基团，例如3 250～3 400 cm-1是羟基基团，脂肪族氨基酸残基分别在2 800～3 000 cm-1和1 440～1 465 cm-1附近归属于C-H拉伸和弯曲模式，蛋白质的红外吸收带主要有3个，其中酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)对研究二级结构最重要，蛋白质的二级结构主要包括β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋及β-转角，分别对应1 600～1 640 cm-1、1 640～1 650 cm-1、1 650～1 660 cm-1和1 660～1 700 cm-1[25]。

内酯豆腐的红外光谱图见图4。

图4 不同GDL添加量制备的内酯豆腐中蛋白质红外光谱分析Fig.4 Infrared spectra analysis of protein in lactone tofu prepared with different GDL addition amount

随着豆浆的加热和GDL添加量的增加，3 250～3 400 cm-1处羟基基团吸收峰强度降低，氢键作用减弱，2 800～3 000 cm-1处C-H拉伸脂肪族氨基酸残基对应的峰面积随着内酯添加量的增加而增大，蛋白质聚集的趋势增大。

表2 GDL添加量对豆腐二级结构的影响Table 2 Effect of GDL addition amount on the secondary structure of tofu

由表2可知，内酯豆腐中蛋白质的二级结构主要由β-折叠和β-转角构成，无规则卷曲和α-螺旋含量较少，随着GDL添加量的增加，β-折叠含量由31.93%增加到38.43%，无规则卷曲含量由13.93%下降到13.78%，α-螺旋含量先升高后降低，由13.96%增加到15.27%又下降到13.98%，β-转角含量由40.18%下降到33.81%。

天然大豆蛋白以α-螺旋结构含量最高，随着加热和豆腐凝胶的形成，蛋白由α-螺旋和β-转角结构转而形成更为有序的β-折叠，这也是豆腐凝胶网络结构的有序形成所导致。

2.6 GDL添加量对豆腐微观结构的影响

通过激光共聚焦扫描观察GDL添加量不同时豆腐的微观结构，图5中浅色区域为蛋白质聚集体区域，而深色区域为网络结构中的孔隙。有研究表明[26]，酸化速率过低或过高均不利于均匀的凝胶结构的形成。图5中A为熟豆乳的激光共聚焦扫描图，图中浅色区域均匀分布，孔径小且密集，表明此时豆乳中蛋白质尚未发生聚集，主要以小分子蛋白形式存在，无凝胶网络结构形成；图5中B为GDL添加量0.2%时豆腐的激光共聚焦扫描图，相比于图A中深色区域增多，表明蛋白质在质子的作用下发生了一定程度的聚集，但由于聚集程度较低，只有极少部分蛋白参与了凝胶结构的形成；图5中C为GDL添加量0.3%时豆腐的激光共聚焦扫描图，图中浅色区域呈连续均匀的蜂窝状分布，形成了明显的网络结构，与图5中B相比，蛋白质聚集体的分布更加均匀，凝胶网络结构更加致密，说明蛋白质聚集程度大幅提高，并且此时酸化速率适宜，尚能形成有序的网络结构；图5中D为GDL添加量0.4%时豆腐的激光共聚焦扫描图，与图5中C相比，深色区域明显增多且分布不均匀，说明由于酸化速率过快，蛋白质聚集沉淀速度过快，不利于形成有序的凝胶结构。豆腐中GDL添加量为0.3%时，其凝胶微观结构最佳，凝胶中蛋白质的交联反应更加充分均匀。

图5 不同GDL添加量豆腐激光共聚焦扫描图Fig.5 Confocal laser scanning diagram of tofu with different GDL addition amount

3 结论

通过对不同GDL添加量的豆腐特性进行研究发现，随着GDL添加量的增加，内酯豆腐的硬度、弹性和聚集性逐渐提高，内聚性几乎不变；内酯豆腐的含水量降低，保水性呈增大趋势；内酯豆腐凝胶中离子键和二硫键先增加后减少，而氢键则先减少后增加，疏水作用增强，可溶性蛋白的亚基条带逐渐减少，蛋白质逐渐向凝胶网络转化，蛋白质二级结构变得更加有序，β-折叠在内酯豆腐蛋白质结构中占比最高，随着GDL添加量的增加，当GDL添加量为0.3%时，其凝胶微观结构中的交联反应最均匀。