代用茶茶汤中功能性成分组成及含量分析

赵珊，杨飞洋，秦琳，李曦，黄世群，郑幸果，雷欣宇，仲伶俐*

（1.四川省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，四川 成都 610066；2.西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

代用茶指除茶以外，以国家行政主管部门公布的可用于食品的植物花及花蕾、芽叶、果（实）、根茎等为原料，经加工制作，采用冲泡（浸泡或煮）的方式，供人们饮用的产品[1]。根据原料的不同，代用茶可分为叶类、花类、果（实）类、根茎类和混合类[1]。目前市场上代用茶的产品种类已超过100种，销量占到传统茶的30%左右[2]，较为常见的代用茶有苦荞、菊花、玫瑰花、枸杞、大枣、金银花、蒲公英、桑叶、决明子、牛蒡根、陈皮、山楂等。代用茶现今较为普遍，主要是由于它们大都富含酚酸、黄酮、氨基酸等功能性成分，具有抗氧化、抗衰老、调节心血管类疾病等功效[3-6]，而且摄入方式也较简单，冲泡即可。目前针对各种代用茶功能性成分的研究较多[7-12]，但综合全面比较多种代用茶的相关研究较少。此外，针对像多酚、黄酮、花青素这类功能性成分的分析多是采用一定比例的有机溶剂进行提取，比如标准GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法》、NY/T 1295—2007《荞麦及其制品中总黄酮含量的测定》和NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》，然而人们日常饮茶都用水冲泡，有机试剂提取测定的含量并不能真实反映从茶汤中摄入的含量，关于代用茶茶汤中功能性成分的含量情况也鲜有研究。本研究以18种代用茶为研究对象，分析其茶汤中的游离氨基酸、多酚、黄酮、花青素、糖类等功能性成分的组成和含量，探究各种代用茶的功能成分差异和食用价值，并探讨两种提取方法对总酚、总黄酮和花青素浸出的影响，为产品开发和消费选择提供新的思路和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

代用茶（1.蒲公英；2.黑苦荞；3.黄金苦荞；4.全株苦荞；5.桑叶茶；6.茉莉花；7.胎菊；8.金盏菊；9.玫瑰花；10.决明子；11.荷叶；12.金银花；13.红枣片；14.黑枸杞；15.山楂片；16.陈皮；17.红枸杞；18.牛蒡根）：市售。

标准品（纯度均大于 97%）：丙氨酸（alanine，Ala）、精氨酸（arginine，Arg）、天冬酰胺（asparagine，Asn），天冬氨酸（aspartic acid，Asp）、胱氨酸（cysteine，Cys）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，Gaba）、谷氨酰胺（glutamine，Gln）、谷氨酸 （glutamic acid，Glu）、 甘氨酸（glycine，Gly）、组氨酸 （histidine，His）、 异 亮 氨 酸（isoleucine，Ile）、亮氨酸（leucine，Leu）、赖氨酸（lysine，Lys）、蛋氨酸（methionine，Met）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、脯氨酸（proline，Pro）、丝氨酸（serine，Ser）、茶氨酸（theanine，The）、苏氨酸（threonine，Thr）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）、缬氨酸（valine，Val）：美国 A chemtek 公司；没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、2-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸、反式肉桂酸、水杨酸、3，5-二羟基苯甲酸、2，3，4-三羟基苯甲酸、龙胆酸、焦儿茶酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、芥子酸、果糖、葡萄糖、蔗糖：美国Sigma-Aldrich公司；绿原酸：德国Dr.Ehrenstorfer公司；新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C：武汉天植生物技术有限公司；1-咖啡酰奎宁酸、1，3-双咖啡酰奎宁酸、1，5-双咖啡酰奎宁酸：成都普瑞法科技开发有限公司；芦丁：日本和光纯药公司；飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、芍药素、锦葵色素：美国ChromaDex公司；福林酚试剂：国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇、无水乙醇、甲酸（均为色谱纯）：上海安谱科技股份有限公司；碳酸钠、乙酸钾、三氯化铝、盐酸、乙酸（均为分析纯）：广东西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-XS超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪：美国Waters公司；1100高效液相色谱仪配二极管阵列检测器和示差折光检测器：美国Agilent公司；UV2550紫外分光光度计、AUY220型电子天平：日本岛津公司；SFG-02B电热鼓风干燥箱：黄石市恒丰医疗器械公司；SHA-CA恒温水浴振荡器：常州荣华仪器制造有限公司；KQ5200DE超声波清洗机：昆明市超声仪器有限公司；UPH-1-20L实验室超纯水仪：四川优普超纯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取液的制备

1.3.1.1 茶汤的制备

准确称取1.0 g粉碎样品于200 mL三角瓶中，加入90 mL的沸水，立即移入沸水浴中浸提30 min，浸提完后冷却至室温，转移至100 mL容量瓶并用水定容，过滤后即为待测茶汤。

1.3.1.2 醇提取物的制备

准确称取1.0g样品于200mL三角瓶中，加入90mL 70%甲醇水溶液于60℃超声辅助浸提30 min，定容至100 mL，过滤后待测。

1.3.2 成分指标测定

1.3.2.1 游离氨基酸的测定

参照GB/T 30987—2020《植物中游离氨基酸的测定》，采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法进行测定，并加以改进和优化。移取1.0 mL茶汤于10 mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀释并定容至刻度，混匀后过0.22 μm微孔过滤膜待测，结果以干基（mg/g DW）表示，重复3次。

色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：25 ℃；进样量：1.0 μL；流动相 A：10 mmol/L 甲酸铵-水溶液；流动相B：10 mmol/L 甲酸铵-乙腈溶液；流速：0.2 mL/min；梯度洗脱程序：0～10.5 min，95%～70%B；10.5 min～11 min，70%～40%B；11 min～12 min，40%B；12 min～12.5 min，40%～95%B；后运行 2.5 min。

质谱条件：离子源为电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）；扫描方式：正离子模式；监测模式：多重反应监测模式（multiple response monitoring，MRM）；毛细管电压2.50 kV；离子源温度150℃；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流量1 000 L/h；碰撞气流速0.15 mL/min；锥孔气流速150 L/h。

标准溶液的配制：称取21种氨基酸标准品各10 mg，分别用0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容至10 mL，贮存于棕色玻璃瓶中，0℃～4℃保存。氨基酸混合标准工作液采用梯度稀释法现配现用。

1.3.2.2 总酚和总黄酮的测定

总酚含量的测定参照文献[13]，以没食子酸为标准品，采用福林酚法测定上述茶汤和醇提取物中总多酚含量，结果以干基样品中没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示（单位为mgGAE/gDW），重复3次。

总黄酮含量的测定参照文献[14]，以芦丁为标准品，采用三氯化铝比色法测定上述茶汤和醇提取物中总黄酮含量，结果以干基样品中芦丁当量（rutin equivalent，RE）表示（单位为 mg RE/g DW），重复 3次。

1.3.2.3 游离酚酸的UPLC-MS/MS分析

将1.3.1茶汤稀释合适的倍数进行UPLC-MS/MS分析，参照文献[15]进行测定，结果以干基（mg/g DW）表示，重复3次。

标准溶液的配制：分别称取酚酸标准品各10mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，贮存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。酚酸混合标准工作液采用梯度稀释法现配现用。

1.3.2.4 花青素的测定

移取1.3.1玫瑰花和黑枸杞样品的茶汤20 mL于磨口锥形瓶中，加入6 mol/L盐酸溶液20 mL，混匀后在沸水浴中回流水解1 h，转移至100 mL容量瓶并定容，取上清液过0.22 μm微孔过滤膜后上机测定飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵色素的含量。采用溶剂为无水乙醇:浓盐酸:水=2:1:1（体积比）对玫瑰花和黑枸杞进行花青素的提取和水解并测定花青素的含量，具体参照标准NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》。色谱柱：采用Waters Sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），上机条件参照标准 NY/T 2640—2014。

1.3.2.5 可溶性糖和多糖的测定

将1.3.1.1茶汤过0.22 μm微孔过滤膜后上机测定果糖、葡萄糖和蔗糖的含量，具体参照GB 5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》，检测器：示差折光检测器；色谱柱：Agilent Polarls NH2（4.6 mm×250 mm，5 μm），；流动相：90%乙腈水溶液；流速1.0 mL/min。

多糖的测定参照SN/T 4260—2015《出口植物食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》并稍加改动，称取样品0.2 g于50 mL具塞离心管中，加入80%乙醇溶液超声30 min、离心后去掉上清液，重复1次。将沉淀用80 mL水转移至具塞三角瓶中，沸水浴30 min后转移至100 mL容量瓶并定容，过滤后待测定，显色方法同SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》。

1.3.2.6 水分和水浸出物的测定

水分采用直接干燥法，参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》；水浸出物参照《中国药典》2020年版通则2201中水溶性浸出物测定法。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 22.0软件进行数据分析和统计分析，采用Origin 2019软件进行图表的绘制。采用单因素方差分析评估不同样品或方法间的统计差异，然后进行LSD检验。

2 结果与分析

2.1 UPLC-MS/MS测定代用茶中游离氨基酸方法的建立与优化

通过优化液相条件和质谱参数，21种氨基酸得到了较好的峰形和分离度。在正离子模式下，分别对21种氨基酸进行扫描，确定特征离子对，进一步优化锥孔电压、碰撞能量、驻留时间等参数，使分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大，确定丰度较高的两个子离子作为定性离子，并选择其中丰度最高的作为定量离子，具体质谱参数见表1。

表1 目标化合物的质谱分析参数Table 1 UPLC-MS/MS parameters for target compounds

2.2 不同代用茶茶汤中的游离氨基酸含量分析

不同代用茶茶汤中游离氨基酸组成与含量见图1。

图1 不同代用茶茶汤中游离氨基酸组成与含量Fig.1 Composition and content of free amino acids in different substitute tea soups

本研究选取的18种代用茶游离氨基酸组成和含量各不相同，其中最多检测出18种，包括Ala、Arg、Asn、Asp、GABA、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Val（图1A），其中含量较高的氨基酸包括Arg、Asn和 Pro，其次是 Gaba、Gln和 Glu。 游离氨基酸总量在大部分代用茶样品中含量差异显著（P＜0.05），含量最高的样品是玫瑰花（42.8 mg/g DW），其次是牛蒡根（38.4 mg/g DW），含量在10 mg/g DW～30 mg/g DW范围的样品有蒲公英、桑叶茶、金盏菊、金银花和红枸杞，含量在5 mg/g DW～10 mg/g DW范围的样品有茉莉花、胎菊、荷叶、红枣片、黑枸杞和陈皮，其余含量低于5 mg/g DW，金盏菊的必需氨基酸组成比例较高（图1B）。

2.3 代用茶茶汤中酚酸、黄酮的含量

18种代用茶茶汤中总酚和总黄酮的含量情况见图2。采用高效液相色谱法测定了玫瑰花和黑枸杞中的6种花青素，结果见表2。

表2 代用茶中花青素的组成与含量Table 2 Composition and content of anthocyanins in substitute teas mg/g DW

图2 不同代用茶茶汤游离酚酸组成与含量Fig.2 Composition and content of free phenolic acids in different substitute tea soups

采用UPLC-MS/MS测定了代用茶茶汤中27种酚酸类成分，发现18种代用茶中主要检测出14种游离酚酸（图2A），包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1，3-双咖啡酰奎宁酸、1，5-双咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、没食子酸、对香豆酸和阿魏酸。含量较高的酚酸有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、1，5-双咖啡酰奎宁酸；大部分代用茶间游离酚酸总量差异显著（P＜0.05），含量较高的样品有胎菊（53.7 mg/g DW）和金银花（54.7 mg/g DW），其次是玫瑰花、桑叶茶、牛蒡根和金盏菊（图2B）。

由表2可知，花青素含量为2.0 mg/g DW～9.3 mg/g DW，天竺葵色素在这两个样品中都未检出，玫瑰花的花青素组成是矢车菊色素和芍药素，黑枸杞的花青素组成是矮牵牛色素、锦葵色素和飞燕草色素。

2.4 提取方式对代用茶中总酚、总黄酮和花青素含量的影响

不同提取方式对代用茶样品中总酚、总黄酮和花青素含量的影响见图3。

图3 不同提取方式对代用茶样品中总酚、总黄酮和花青素含量的影响Fig.3 Effects of different extraction methods on the contents of total phenols，total flavonoids and anthocyanins in substitute teas

总酚的含量为 7.66 mg GAE/g DW～181.05 mg GAE/g DW，含量最高的是玫瑰花，最低的是茉莉花。总酚含量超过30 mg GAE/g DW的样品有胎菊、玫瑰花、荷叶、金银花、黑枸杞、山楂片和牛蒡根。茶汤中总黄酮含量为1.27 mg RE/g DW～41.03 mg RE/g DW，含量最高和最低的分别是荷叶和红枣片。总黄酮含量超过20 mg RE/g DW的样品有茉莉花、胎菊和荷叶，含量在10 mg RE/g DW～20 mg RE/g DW的样品有黑苦荞、黄金苦荞、桑叶茶、玫瑰花和金银花。

醇提总酚含量为13.7mgGAE/gDW～182.0mgGAE/g DW，醇提总黄酮含量为2.0 mg RE/g DW～53.5 mg RE/g DW，醇提花青素含量为2.2 mg/g DW～10.5 mg/g DW。通过结果对比发现，醇提取的总酚、总黄酮和花青素含量大都高于茶汤，且不同样品间差异不同。两种提取方式下，蒲公英、桑叶茶、胎菊、玫瑰花、金银花、山楂片和红枸杞的总酚含量间差异不显著（P＞0.05），其余代用茶样品差异显著（P＜0.05），全株苦荞和茉莉花茶汤总酚分别占醇提总酚的29.0%和36.2%，其余样品中茶汤总酚占醇提总酚的64.1%以上；除玫瑰花以外，两种提取方式在不同代用茶样品的总黄酮含量间差异显著（P＜0.05），蒲公英、全株苦荞、黑枸杞和山楂片的茶汤总黄酮分别占醇提总黄酮的37.2%、50.1%、38.8%和34.7%，其余样品茶汤总黄酮占醇提总黄酮的61.2%以上。两种提取方式下的花青素含量差异显著（P＜0.05），玫瑰花和黑枸杞茶汤花青素总量分别占醇提花青素总量的94.7%和88.4%。

2.5 代用茶中水浸出物、可溶性糖和多糖含量

不同代用茶中水浸出物、可溶性糖和多糖的含量见表3。

表3 不同代用茶中水浸出物、可溶性糖和多糖的含量Table 3 Contents of water extract，soluble sugar and polysaccharide in different substitute teas %DW

18种代用茶样品中水浸出物的含量是13.1%DW～86.6%DW，其中3种苦荞、决明子和荷叶的水浸出物含量低于30%，5种花类、蒲公英和桑叶茶含量范围为30%～50%DW，果实类和牛蒡根的含量高于50%。其中糖含量占水浸出物的比例较高，为12.1%～98.0%。

果实类中以果子为材料的代用茶中可溶性糖含量都较高，为32.7%DW～83.6%DW，果实类中以种子为材料的代用茶中未检出可溶性糖，叶类和花类不同样品间差异较大，含量为1.1%DW～21.2%DW。

18种代用茶中有15种测定出不同含量的多糖，而3种苦荞样品溶液遇碘变蓝，说明是可溶性淀粉。多糖的含量是1.2%DW～6.4%DW，可溶性淀粉含量是5.2%DW～9.5%DW，多糖含量较高的是金盏菊、决明子、金银花、陈皮和红枸杞，含量较低的是红枣片和牛蒡根。

3 结论与讨论

3.1 代用茶中功能性成分的组成与含量

18种代用茶茶汤的主要成分有可溶性糖、多糖、游离氨基酸、酚酸、黄酮等，部分含有花青素。不同成分间含量差异较大，水浸出物含量为13.1%DW～86.6%DW；可溶性糖含量为1.1%DW～83.6%DW；多糖含量为1.2%DW～6.4%DW；总酚含量为7.7 mg GAE/g DW～181.1 mg GAE/g DW；总黄酮含量为1.3 mg RE/g DW～41.0 mg RE/g DW；游离氨基酸含量为1.0 mg/g DW～42.8 mg/g DW，共检出18种，含量较高的有Arg、Asn和Pro；游离酚酸含量为0～54.7 mg/g DW，共检出14种，大都是绿原酸类化合物；花青素含量为2.0 mg/g DW～9.3 mg/g DW。玫瑰花的游离氨基酸和总酚含量最高，荷叶总黄酮含量最高，金盏菊多糖含量最高，金银花和胎菊中绿原酸类成分含量较高，黑枸杞中矮牵牛色素含量较高。此外，功能性成分的组成和含量还与品种、产地、生产方式等相关[16-18]。除了本研究测定的成分，不同的代用茶还有其特有的活性成分，如蒲公英有萜类和甾醇等[19-20]，桑叶有生物碱等[21]。

3.2 功能性成分在代用茶茶汤中的浸出情况

不同的功能性成分有着不同的化学性质和溶解性，不同的代用茶中功能性成分也千差万别，因此，采用水对代用茶进行冲泡浸出的大都是水溶性成分。水溶性的活性成分有糖类、有机酸、氨基酸、水溶性维生素、核苷类、皂苷等[22]，黄酮、多酚类物质部分溶于水，主要取决于这部分物质的化学结构、酚羟基数量、结合糖苷情况等[23]。本研究中不同提取溶剂对代用茶样品中总酚和总黄酮提取的结果表明，茶汤中总酚、总黄酮和花青素的含量除少数样品外，大部分样品为醇提取的60%以上。水提和醇提对代用茶中多酚和黄酮的提取差异与样品本身有关，综上认为水提和醇提的差异主要取决于样品所含的多酚和黄酮类成分的差异及其水溶性。此外，冲泡方式和冲泡条件对代用茶活性成分的浸出有着较大的影响，不同的代用茶需根据具体情况选择合适的冲泡方式和冲泡条件[24-27]。