超高压处理对海湾扇贝柱冷藏保鲜效果的影响

金婧彧，王颉，吴紫茼，锁然，马倩云，张彤，冯佳齐，刘亚琼

（河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000）

海湾扇贝（Argopeten iradians），别名大西洋内湾扇贝，是我国最重要的海水养殖贝类之一[1]。扇贝闭壳肌即扇贝柱，是一种集食、药、滋补为一体的重要水产品[2]。扇贝肉质鲜美可口，主要营养成分是蛋白质，还含有牛磺酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、胆碱、多糖等多种生物活性物质，具有抗肿瘤、降血脂、抗衰老等多种生物功能[3]。海湾扇贝捕捞后，在微生物和体内酶的作用下极易发生腐败变质，失去食用价值，直接影响其经济价值。目前，新鲜扇贝柱通常采用冻藏保存。随着人们生活节奏的加快，即烹食材越来越受到消费者的青睐，但未经处理的冷藏水产品保鲜期短、极易败坏，存在潜在的食品安全风险。

超高压（ultra-high pressure，UHP）技术是一种非热加工处理方式，以水、油等液体作为媒介传递压力，在100 MPa～1 000 MPa超高压条件下处理食品，会导致食品中的微生物菌体死亡及蛋白质变性等，从而达到杀菌保鲜的目的[4]。与传统热处理相比，超高压技术既可以杀灭食品中的微生物、钝化酶的活性，还可以较好地保持食品原有的品质和营养成分。目前超高压技术在鱼糜加工、协助贝类脱壳和保鲜等方面均有广泛应用[5]。 王汇川等[6]研究压力 200、300、400 MPa，保压时间5、10 min的超高压条件对鲈鱼鱼糜品质和凝胶特性的影响，结果表明，在300 MPa/10 min时鲈鱼鱼糜品质改善程度最大，较热处理有显著提升，是一种比较合适的处理条件。叶韬等[7]利用超高压技术对中华绒螯蟹进行辅助脱壳处理，结果表明，适宜工艺参数为压力440 MPa，时间16 min，温度60℃，此时分割得率为34.24%，产品品质得分为42.50。赵宏强等[8]研究超高压处理对冷藏鲈鱼片品质及组织结构变化的影响，在 200、250、300 MPa，保压时间为 9 min 的超高压条件下测定菌落总数、pH值、持水率、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）、质构等指标，结果表明，超高压处理能抑制样品的脂肪氧化和微生物生长，但会对样品外观、色泽及持水力产生不利影响；250 MPa、9 min超高压处理的综合评价效果相对较好，鲈鱼片的冷藏货架期能至少延长4 d。然而超高压处理后海湾扇贝柱在冷藏过程中品质与蛋白质氧化的研究较少。

因此，本研究中以海湾扇贝柱为原料，测定新鲜海湾扇贝柱在冻藏过程中和经超高压处理后的海湾扇贝柱在4℃冷藏过程中，其菌落总数、TVB-N、色泽、羰基、总巯基和活性巯基含量以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 的变化规律，旨在为超高压处理海湾扇贝柱的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜海湾扇贝：2020年10月捕捞于河北省秦皇岛市。将剥壳后的海湾扇贝柱清洗后挑选，平均直径为（15.0±0.5）mm，平均高度为（20.0±0.5）mm，平均质量为（5.0±1.0）g。

平板计数琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限公司；盐酸胍、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNHP）、三氯乙酸、盐酸、氯化钠、乙二胺四乙酸、尿素、氧化镁、三氯乙酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂：国药集团化学试剂有限公司；乙醇、硼酸：天津新通精细化工有限公司；乙酸乙酯：天津市天力化学试剂有限公司；Tris-甘氨酸电泳缓冲液（5×）、戊二醛固定液（2.5%）：北京雷根生物技术有限公司；彩色预染蛋白Maker：上海威奥生物科技有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、SDS-PAGE上样缓冲液（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂：康为世纪生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HPP 600MPa/5L超高压设备：天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司；CR-400色彩色差计：柯尼卡美能达控股公司；DHP-9162恒温培养箱：太仓市科教器材厂；K1100全自动凯氏定氮仪：济南海能仪器股份有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；CP214电子分析天平：奥斯豪仪器（上海）有限公司；JY300C电泳仪：北京君意设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

将新鲜的海湾扇贝柱随机分成两组（5kg/组），一组未经任何处理于-18℃冻藏（对照组，CK），一组装入聚乙烯袋子后真空包装，放置于超高压设备中的压力腔内，以水为压力介质，在常温下，对其进行600 MPa/5 min的超高压处理（处理组，UHP）。每10 d对两组样品进行指标测定，所有样品应尽快完成各项指标的检测。

1.3.2 菌落总数测定

菌落总数的测定采用平板计数法，具体操作参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。

1.3.3 TVB-N含量测定

TVB-N含量按照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中自动凯氏定氮仪法的操作方法进行测定。

1.3.4 色泽测定

使用色彩色差计对海湾扇贝柱的颜色进行测定，色彩色差计使用前应该先进行白板校正，然后再对样品进行测定。分别记录样品的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*），每次对10个样品进行测定。基于以上测得的数据计算出样品总颜色的变化（ΔE*），ΔE*计算公式如下。

式中：L0*、a0*、b0*为新鲜海湾扇贝柱的初始色泽参数；L*、a*、b*为经过处理后海湾扇贝柱的色泽参数。

1.3.5 肌原纤维蛋白提取

海湾扇贝柱肌原纤维蛋白的提取参考姜晴晴[9]的方法，并进行适当修改。称取5 g样品，按1:10（g/mL）与缓冲溶液A[20 mmol/L磷酸盐缓冲液，含0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA），pH7.0]混合均匀，均质 1 min，离心（4℃，10 000 r/min，10 min）后取沉淀，重复上述操作两次。将两次沉淀混合并加入缓冲溶液B（25 mmol/L 磷酸盐缓冲液，含 0.6 mol/L NaCl，pH7.0），匀浆后冰浴2 h，过滤除去不溶性部分，所得滤液即为肌原纤维蛋白溶液，肌原纤维蛋白溶液储存在4℃冰箱不超过72 h。以牛血清蛋白作标准曲线，采用双缩脲法测定蛋白浓度，并用缓冲溶液B调节蛋白浓度。

1.3.6 羰基含量测定

参考石径[10]的方法并作适当修改，测定肌原纤维蛋白的羰基含量。将肌原纤维蛋白稀释至2 mg/mL，取0.2mL的蛋白稀释液加入0.4mL的DNHP，混合均匀后于37℃避光反应1h，每隔10min振荡1次。加入0.5mL的20%三氯乙酸溶液，混合均匀后离心（10 000 r/min，10 min，4℃）弃上清液，沉淀用1 mL乙醇和乙酸乙酯混合液（1:1，体积比）洗涤3次，然后在沉淀中加入3 mL盐酸胍溶液（6 mol/L），370 nm处测定吸光度。空白用0.2 mL盐酸（2 mol/L）代替蛋白稀释液，试验重复3次。羰基含量的计算公式如下。

式中：A370为370 nm处的吸光度；D为稀释倍数；ε为分子吸光系数，22 000 L/（mol·cm）；C为肌原纤维蛋白溶液的浓度，mg/mL。

1.3.7 总巯基和活性巯基含量测定

总巯基含量的测定根据Wei等[11]的方法并作适当修改。将肌原纤维蛋白溶液用缓冲溶液B稀释至1 mg/mL，取0.5 mL的蛋白稀释液于离心管中，加入4 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（含0.6 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，8 mol/L 尿素，pH7.0），混合均匀后，加入0.5 mL 10 mmol/L 2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoic acid，DTNB），充分混匀，在4℃条件下避光反应1 h，然后于412 nm处测定吸光度。测定活性巯基含量时去掉磷酸缓冲液中的尿素，其余步骤同上，每个样品做3次平行。巯基含量计算公式如下。

式中：A412为412 nm处的吸光度；D为稀释倍数11；ε为摩尔消光系数，13 600 L/（mol·cm）；C为肌原纤维蛋白溶液的浓度，mg/mL。

1.3.8 SDS-PAGE测定

参考李长乐等[12]的方法并作适当修改，将肌原纤维蛋白溶液稀释至2 mg/mL，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电泳电压为120 V。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色1 h，脱色至背景清晰，用凝胶成像系统对电泳图谱进行扫描分析。

1.4 数据处理与统计分析

使用SPSS 20软件进行单因素方差分析、Duncan检验，并用Origin 2018版进行图表绘制。数据结果采用平均值±标准差形式表示。

2 结果与分析

2.1 菌落总数的变化

食品中微生物的生长繁殖会导致食品腐败变质，因此菌落总数可以直接用来评价水产品的品质好坏，是衡量新鲜度的一个重要指标。新鲜的水产品菌落总数可接受上限为7 lg（CFU/g）[13]，超过这个上限就被判定为水产品腐败变质。海湾扇贝柱在贮藏过程中菌落总数的变化趋势如图1所示。

图1 海湾扇贝柱贮藏过程中菌落总数的变化Fig.1 Changes in aerobic bacterial count of Argopecten irradians adductor muscle during storage

从图1中可以看出，对照组样品第0天时菌落总数为3.34 lg（CFU/g），经超高压处理后，海湾扇贝柱的菌落总数降低，降低至1.81 lg（CFU/g）。这表明超高压处理能够有效地杀灭海湾扇贝柱中的部分微生物并抑制酶的活性，提高海湾扇贝柱的食用安全性。超高压处理会使微生物的细胞结构被破坏，细胞膜破裂，蛋白质结构也会发生改变，从而引起微生物死亡，菌落总数减少[14]。随着贮藏时间的延长，海湾扇贝柱中的微生物大量繁殖，菌落总数均呈上升的趋势，对照组样品贮藏90 d后菌落总数达到4.88 lg（CFU/g），超高压处理组样品贮藏90 d后菌落总数为5.71 lg（CFU/g），均低于规定的限量标准。结果表明，超高压处理能够有效地抑制微生物的生长繁殖，保证冷藏海湾扇贝柱的食用安全性。

2.2 TVB-N含量的变化

TVB-N含量的多少能够直接反映水产品腐败变质的程度，是评价水产品新鲜度的一个重要参数，TVB-N的含量越高，水产品腐败越严重。海湾扇贝柱在贮藏过程中TVB-N含量的变化如图2所示。

图2 海湾扇贝柱在贮藏过程中TVB-N含量的变化Fig.2 Changes in TVB-N content of Argopecten irradians adductor muscle during storage

从图2中可以看出，对照组样品的初始TVB-N含量在3.03 mg/100 g左右，经超高压处理后海湾扇贝柱的TVB-N含量降低，减少了28.79%。TVB-N含量的减少可能是由于较高的压力使得挥发性盐基氮中的一些物质随着水分的流失而减少[15]。随着贮藏时间的延长，对照组样品和处理组样品的TVB-N含量均呈现增加的趋势。根据GB 2733—2015《鲜、冻动物性水产品》的规定，我国冷冻贝类中的TVB-N含量应低于15 mg/100 g。贮藏结束后，对照组样品和处理组样品的TVB-N含量分别达到11.20、11.99 mg/100 g，仍在规定的限量范围之内。以上结果表明，超高压处理能够显著抑制海湾扇贝柱冷藏过程中TVB-N的生成，减缓其腐败变质。

2.3 色泽的变化

色泽是评价水产品品质的一个重要指标，直接影响着水产品的外观，也是决定消费者可接受度的一个主要因素。海湾扇贝柱在贮藏过程中L*、a*、b*、ΔE*值的变化如表1所示。

由表1可知，超高压处理后海湾扇贝柱的颜色发生明显变化，L*值和b*值高于未处理样品，这可能是因为超高压处理后海湾扇贝柱蛋白质发生变性，导致其表面颜色发生变化。随着贮藏时间的延长，对照组样品的L*值呈现逐渐减小的趋势，b*值呈现逐渐增加的趋势，a*值没有明显的变化，说明冻藏的时间越长，海湾扇贝柱被氧化的程度越大，颜色越暗；而处理组样品的L*值和b*值随贮藏时间延长呈上升趋势，a*值逐渐降低。处理组和对照组样品的总色差（ΔE*）变化趋势相同，均随贮藏时间的延长色泽变化越来越明显[16]。综上所述，超高压处理显著提高了海湾扇贝柱的亮度，但随着贮藏时间的延长，海湾扇贝柱的颜色可能会由于蛋白质的氧化变性、脂肪的氧化以及色素降解等反应而发生一定程度的变化，从而导致消费者的可接受程度下降[17]。

表1 海湾扇贝柱贮藏过程中颜色的变化Table 1 Changes in color of Argopecten irradians adductor muscle during storage

2.4 羰基含量的变化

蛋白质羰基化是蛋白质氧化的一个显著特性，羰基是蛋白质氧化过程中重要的生成物[18]。因此，蛋白质羰基含量通常被用来表示蛋白质氧化的程度，含量越高表明蛋白质氧化程度越大，是评价蛋白质氧化最常用的一个重要指标。海湾扇贝柱贮藏过程中肌原纤维蛋白羰基含量变化如图3所示。

图3 海湾扇贝柱贮藏过程中羰基含量的变化Fig.3 Changes in carbonyl content of Argopecten irradians adductor muscle during storage

由图3可以看出，海湾扇贝柱肌原纤维蛋白的羰基含量随着贮藏时间的延长呈逐渐升高的趋势。表明两组样品在贮藏过程中蛋白质均发生了一定程度的氧化，并且贮藏时间越长，蛋白质氧化程度越严重。对照组样品的羰基含量由最初的4.54 nmol/mg增长至14.12 nmol/mg，处理组样品的羰基含量由8.70 nmol/mg增长至17.86 nmol/mg，分别增长了2.11倍和1.05倍。羰基含量的增加说明海湾扇贝柱在贮藏期间发生了明显的蛋白氧化，经超高压处理后海湾扇贝柱的蛋白质空间构象发生改变，肌原纤维蛋白发生聚集和折叠，表征为羰基含量上升[19]。结果表明，超高压处理在一定程度上会导致海湾扇贝柱在贮藏过程中肌原纤维蛋白的变性和氧化。

2.5 总巯基和活性巯基含量的变化

巯基是水产品蛋白质中最具活性的功能性基团，对于稳定肌原纤维蛋白的结构具有重要作用[20]，可以通过测定贮藏过程中海湾扇贝柱总巯基和活性巯基含量的变化来反映其蛋白质氧化程度。贮藏过程中海湾扇贝柱肌原纤维蛋白总巯基与活性巯基含量变化趋势如图4所示。

由图4可知，随着贮藏时间的延长，总巯基与活性巯基含量均呈下降趋势，与贮藏第0天相比，贮藏结束时，对照组和处理组样品的总巯基含量分别减少了68.45%和90.91%，活性巯基的含量分别减少了91.84%和93.05%。总巯基和活性巯基含量下降是因为肌球蛋白头部区域的结构发生了改变，并且蛋白质在氧化过程中空间结构发生改变，巯基被暴露，极易氧化生成二硫键等化合物，导致巯基含量的降低[21]。结果表明，超高压处理组和冻藏对照组样品在贮藏期间均易产生蛋白质氧化。

图4 海湾扇贝柱在贮藏过程中总巯基和活性巯基含量的变化Fig.4 Changes in total and reactive sulfhydryl content of Argopecten irradians adductor muscle during storage

2.6 SDS-PAGE电泳

肌原纤维蛋白又称为盐溶性蛋白，主要有肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC，220 kDa）、肌动蛋白（actin，AC，42 kDa）、原肌球蛋白（36 kDa）、肌原蛋白（33 kDa） 和肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC，17 kDa）等，其中肌球蛋白重链和肌动蛋白是最重要的两个条带。在贮藏过程中海湾扇贝柱肌原纤维蛋白的SDS-PAGE谱图如图5所示。

图5 海湾扇贝柱在贮藏过程中的SDS-PAGE电泳谱图Fig.5 SDS-PAGE electrophoregram of Argopecten irradians adductor muscle during storage

从图5a可以看出，随着贮藏时间的延长，对照组样品的220 kDa（肌球蛋白重链）、97 kDa（副肌球蛋白）以及42 kDa（肌动蛋白）条带在一定程度上变浅，并且在肌动蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白附近出现了新的小分子量条带，这表明冻藏会引起肌原纤维蛋白氧化，降解为小分子的蛋白或者多肽甚至游离氨基酸，在电泳图谱上表现为蛋白条带变浅；而超高压处理组样品（图5b）肌球蛋白重链条带消失，说明超高压处理使蛋白质发生变性，并随着贮藏时间的延长，处理组样品的97 kDa（副肌球蛋白）及36 kDa（原肌球蛋白）条带逐渐变浅，说明肌原纤维蛋白在冷藏过程中发生了降解。综上表明，超高压对冷藏期间海湾扇贝柱蛋白质降解有一定的抑制作用，可以缓解海湾扇贝柱品质的劣化。

3 结论

超高压处理能够有效保证新鲜海湾扇贝柱的冷藏安全性，真空包装新鲜海湾扇贝柱经600 MPa/5 min超高压杀菌后，在4℃贮藏90 d过程中，菌落总数和TVB-N含量均未超标，接近冷冻保鲜效果；随贮藏时间延长，处理组样品L*值和b*值增加，而对照组冷冻样品L*值减少，b*值增加；处理组样品肌原纤维蛋白的羰基含量上升，总巯基和活性巯基含量下降，表明超高压处理在一定程度上能够减少海湾扇贝柱在冷藏过程中肌原纤维蛋白的变性和氧化。综合考虑，超高压处理可以为新鲜海湾扇贝柱的冷藏保鲜提供一定的理论基础和科学依据。