骨髓间充质干细胞通过调节免疫及炎性反应治疗膝骨性关节炎机制的研究进展

张文豪综述 向文远,方锐审校

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种由于关节软骨细胞和软骨退化引起的退行性病变,关节软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨的合成失衡是退化过程中的一种病理特征[1]。关节软骨是关节面的重要组成部分,可起到缓冲、促进关节液流动和分散下肢力学传导等作用。膝关节软骨退化后,降解产物可引起软骨细胞凋亡,造成软骨损伤,并伴有软骨下骨和滑膜的改变。目前,早期OA的治疗包括使用抗炎镇痛药物、软骨保护药物、关节镜下清理等方法[2]。但这些措施只能缓解临床症状,轻度改善患者生活质量,并不能延缓OA的退变,特别是对于晚期OA的效果更是不佳。晚期OA可采用人工膝关节假体表面置换术,缓解疼痛,提高生活质量,然而,关节置换后的一系列并发症及费用等问题也极大限制人工关节置换的应用[3]。

间充质干细胞 (marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是再生医学中理想的种子细胞,不仅具备多向分化、自我更新以及免疫调节和抗炎的特点,还参与损伤组织的修复[4],这为OA治疗提供一种新思路, BMSCs是一种来源于骨髓基质的具有多向分化潜能及自我更新的干细胞,BMSCs 可以分化为不同类型的组织,包括脂肪、软骨和骨骼;BMSCs 还可以进行自我更新并产生免疫调节反应,BMSCs 在软骨损伤和关节疾病的治疗中得到了积极的应用[5]。因此通过查阅相关研究,对BMSCs通过免疫反应和炎性反应治疗OA的主要机制做一综述,为BMSCs对OA的诊疗提供新的思路。

1 BMSCs治疗OA的免疫反应机制

膝关节滑膜炎是OA发生发展过程中的重要病理变化过程,其主要特征是滑膜组织增生,而引起巨噬细胞聚集和软骨细胞分泌功能障碍,故膝关节滑膜炎与滑膜巨噬细胞的极化密切相关,巨噬细胞极化与OA的发生发展同样密切相关[6]。巨噬细胞在不同微环境下可分为经典激活的M1巨噬细胞和交替激活的M2巨噬细胞两种极化状态[7]。M1巨噬细胞在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)刺激后,分泌大量促炎细胞因子,如白介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等,引发机体的免疫及炎性反应[8]。BMSCs通过其分泌的外泌体对巨噬细胞进行调节,外泌体是直径30～150 nm的囊泡结构,其含有多种成分,包括蛋白质、DNA、mRNA、微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA),在细胞间通讯中发挥着重要作用[9]。而间充质干细胞来源外泌体的调节主要通过促进巨噬细胞从 M1向M2的极化来延缓OA进展[10]。He等[11]研究表明,间充质干细胞来源外泌体的miR-223可促进M2巨噬细胞的极化,加速皮肤伤口的愈合。细胞外小泡(extracellular vesicles,EVs)是另一个调节巨噬细胞免疫途径的方式,可产生与外泌体相似的治疗效果;Li等[12]发现人脐带间充质干细胞胞源性EVs可以通过传递miRNAs和相关蛋白来调节PI3K-Akt信号通路, 减缓OA进展。

OA患者滑膜中存在T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞浸润,说明免疫细胞在OA的发病机制中扮演重要角色[13]。T细胞是OA滑膜液中淋巴细胞的主要成分,根据功能的不同,T细胞可分为辅助性T细胞(Th细胞)、细胞毒性T细胞(TC细胞)和调节性T细胞(Tregs),前两者统称为效应性T细胞,Th细胞可分为Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞, Th17细胞主要生成IL-17和IL-23,这两种细胞因子的过度表达促进免疫细胞的渗透、血管内皮生长因子的分泌以及微血管生成,进而加剧软骨退变[14]。高水平的CD4+T细胞(激活后分化为Th细胞)和CD8+T细胞亚群(激活后主要分化为TC细胞),对于OA的发病具有重要意义[15]。同时随着软骨基质的分解产物暴露出来,B细胞可以被刺激产生自身抗体,如软骨间皮素、骨桥蛋白、蛋白多糖,激活体液免疫致关节微环境的紊乱[16]。故T细胞在OA的发生及发展中产生了重要作用,而如何通过BMSCs减少效应T细胞的生产以及增加调节性T细胞的产出,减缓关节软骨的退变,是下一步进行研究的重要方向。

Ogawa等[17]研究发现小鼠BMSCs分泌的一氧化氮可直接暂停细胞周期来调节T细胞的免疫抑制反应,以及BMSCs分泌的细胞因子如TGF-β和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF),吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3- dioxygenase,IDO)来抑制T细胞的增殖并诱导活化的T细胞凋亡[18]。色氨酸是维持T细胞激活和增殖所必需的氨基酸。当色氨酸浓度较低时,T细胞增殖受阻于G1期,导致T细胞数量减少,IDO介导的色氨酸只抑制激活的T细胞,而不抑制静止的T细胞[19]。BMSCs分泌的细胞因子不仅可以抑制T细胞的增殖和诱导其凋亡,还可以抑制初始T细胞的活化,改变T细胞亚群的分化过程。MSCs分泌的细胞因子可抑制促炎T细胞并诱导Tregs导致TNF-α和IL-12的产生减少,而IL-10的产生增加,当微环境中的IL-10浓度达到一定水平时,分泌人类白细胞抗原-G5(HLA-G5),减弱CD4+T细胞对TH1和TH17的激活,并诱导Treg的产生从而形成正反馈循环[20]。BMSCs与T细胞的直接接触在T细胞的免疫调节中也起着重要作用,如细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的表达是BMSCs通过增加BMSCs与T细胞之间的黏附而对T细胞发挥免疫抑制作用[21]。这说明BMSCs通过分泌细胞因子,减少TNF-α等促炎因子的生产,而增加IL-10等抗炎因子的作用,该方式在免疫抑制作用中发挥重要作用。

BMSCs对B细胞的调节不仅通过分泌细胞因子,而且通过细胞间的接触,BMSCs抑制B细胞中丝氨酸/苏氨酸激酶和p38丝裂原激活蛋白激酶的磷酸化,而促进了ERK1/2的磷酸化[22]。另一研究发现,BMSCs可通过上调IL-10显著增强B细胞的免疫调节活性[13]。Chen等[23]发现BMSCs可调节CD23+、CD43+Breg细胞,从而抑制促炎细胞因子的分泌和T细胞的增殖。Rafei等[24]发现BMSCs通过趋化因子CCL2抑制转录因子信号转导和转录激活因子3(STAT3)的表达,进而通过诱导配对的PAX5蛋白质合成,从而抑制浆细胞中免疫球蛋白的分泌。BMSCs被证明具有广泛的免疫调节能力,并能够抑制在OA发生和发展中的大部分免疫细胞。在旁分泌(细胞间接触)和旁分泌方式(通过产生可溶性因子)中,BMSCs抑制炎性M1巨噬细胞的激活,促进其向抗炎、M2表型的转化;抑制NK细胞的增殖和细胞毒性,防止自身反应性B细胞的激活和自身反应性抗体的产生,抑制炎性CD4+Th1细胞的激活,促进免疫抑制的CD4+T调节细胞(Tregs)的产生,从而能够减轻关节炎性反应[25]。另一个方面,BMSCs通过抑制NK细胞产生IFN-γ,促进髓系来源的抑制细胞TGF-β,细胞通过CD-39/CD-73/ADO途径,将表达CD73的BMSCs与表达CD39的活化T细胞共同发挥免疫调节作用,如抑制血小板聚集和活化,激活T细胞,降低NK细胞活性,诱导CD73+NK细胞使其处于静止状态[26]。骨髓间充质干细胞表达和分泌程序性细胞死亡配体1(PD-L1)及程序性细胞死亡配体2(PD-L2),BMSCs表面的PD-L1与B细胞表面的PD-1相互作用,抑制B细胞的增殖和浆细胞分化[15,18,26]。总之,BMSCs可从B细胞和T细胞的多个方面去减少免疫反应对OA软骨细胞造成的损伤,减缓OA的进展。

BMSCs的免疫调节是通过旁分泌以及通过广泛的生物活性分子,包括细胞因子、趋化因子、生长因子等细胞与细胞之间的接触来进行的,从而影响天然免疫和获得性免疫[26]。PGE2是一种由环氧合酶-1(COX-1)和环氧合酶-2(COX-2)产生的花生四烯酸的脂质中间体,这两种酶通常由BMSCs合成,虽然不同来源BMSCs都合成PGE2,但合成剂量及效能存在差异性[27]。PGE2与免疫细胞上的受体EP2和EP4相互作用,通过激活腺苷环化酶,增加细胞内CAMP的水平,导致抗炎细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10)的表达,并以IL-2依赖的方式抑制促炎细胞因子产生,而且抑制NK细胞产生IFN-γ,促进产生TGF-β,PGE2还通过促进Th-2和抑制Th-1发挥免疫抑制作用[22,25]。

肝细胞生长因子(HGF)是一种由BMSCs表达和分泌的免疫调节细胞因子,通过HGF受体作用于CD14+单核细胞,通过ERK1/2途径诱导IL-10的产生,CD14+调节T细胞从Th1到Th2变化[28]。由BMSCs表达的人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLAG)可与多种免疫细胞表面的受体结合产生免疫调节作用,比如通过减少NK细胞、细胞毒性T细胞的杀伤、同种异体T细胞的增殖、树突状细胞成熟等途径[29],还可通过抑制Th1/Th17细胞因子的分泌以及诱导Th2型细胞产生高水平IL-10,抑制NK细胞分泌IFN-γ,减轻免疫反应[15,22,26]。肿瘤坏死因子刺激基因6(tumor necrosis factor stimulated gene 6 ,TSG6)是BMSCs参与免疫调节作用的重要因子,TSG6通过直接调节中性粒细胞与内皮的黏附,促进调节性T细胞的扩张,并抑制中性粒细胞的聚集,通过与巨噬细胞上的CD44结合,干扰TLR2/NF-κB途径,导致中性粒细胞的渗透减少,并与透明质酸片段结合,从而减弱其促炎作用[30]。BMSCs表达可溶性蛋白质(galectins,Gal)与细胞表面糖蛋白结合,Galectin-1调节树突状细胞迁移、信号和分化,并抑制淋巴细胞和中性粒细胞向炎性组织的聚集,Galectin-1和Sema-3A一起与T细胞上表达的受体NP-1结合,抑制T细胞的增殖,从而抑制炎性反应,Galectin-9与Th1细胞表面受体TIM-3特异性结合,诱导Th1细胞死亡,Galectin-9可损害B细胞的增殖和活性[31],从而延缓OA的发生与发展,但是其具体通路及机制仍需进一步研究。

补体系统是先天防御机制的组成部分,主要作用是保护宿主免受感染。一旦激活,补体蛋白作为趋化因子和炎性大因子发挥作用,导致受损细胞和组织的细胞溶解,补体系统由30多种蛋白质组成,它可以通过3种不同的途径激活:(1)经典途径;(2)MBL途径;(3)旁路途径。这3种途径中的每一种都会导致产生惰性的C3转化酶,它将C3裂解成C3a和C3b,可以参与形成不同的复合物。最终,补体级联的结果是激活C5,启动C5b-7复合物的形成,最终形成膜攻击复合物(membrane attack complexes,MAC),导致细胞裂解[32]。间充质干细胞具有免疫特权,可以逃避宿主免疫系统的监视,其原因是其强大的免疫抑制活性的特性。BMSCs可表达可溶性因子H,补体调节蛋白CD46、CD55和CD59,使BMSCs能够在一定程度上抑制补体系统的激活[33-34]。

2 BMSCs治疗OA的炎性反应机制

OA过度激活引起的炎性反应造成膝关节软骨退变加剧,BMSCs通过M2巨噬细胞抗炎作用,分泌抗炎细胞因子,如IL-4、IL-10和TGF-β,抑制炎性反应的过度激活,从而抑制OA的进展[8]。MSCs 源性EVs同时促进M2巨噬细胞的极化,下调促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,上调抗炎细胞因子IL-10的水平,TGF-β和其他抗炎细胞因子(IDO、PGE-2、IL-10)可诱导巨噬细胞极化为M2抗炎表型,其中前列腺素E2(PGE-2)可以与巨噬细胞表面的EP2和EP4受体结合,改变下游基因的表达,并导致巨噬细胞向M2表型转化。这表明外泌体、EVs和巨噬细胞极化在膝骨性关节炎的发展和治疗中的重要性。它们提供了潜在的治疗策略,通过调整巨噬细胞的极化状态和调节炎性因子的表达,有助于减轻膝骨性关节炎的炎性反应,并促进修复和再生过程[12]。中性粒细胞通过联合单核细胞和其他免疫细胞产生抗炎和愈合能力,进而可分为促炎中性粒细胞(N1)和抗炎中性粒细胞(N2)[35]。Cai等[36]研究发现中性粒细胞可与BMSCs的相互作用,不同水平的IL-8被认为是一种中性粒细胞趋化细胞因子。在小鼠实验模型中,观察到损伤的软骨出现类骨折血肿的现象,N2极化后向BMSCs分泌基质细胞衍生因子1α(SDF-1α),通过SDF1/CXCR4途径及其下游的PI3K/AKT途径,可促进软骨的修复。OA患者关节液中存在中性粒细胞弹性蛋白酶,可通过激活PAR2及MMP-13产生一系列反应造成软骨损伤,而BMSCs可抑制PAR2的激活,减轻软骨损伤[37]。另一研究发现通过敲除小鼠PAR2基因,发现PAR2有助于BMSCs的成骨分化,而不是脂肪生成,以及抑制BMSCs的IL-6表达似乎是PAR2抑制脂肪形成的一个机制,从而减少骨质疏松的发生[38]。Akbar等[39]发现BMSCs可产生α-抗胰蛋白酶,减少软骨损伤的同时避免骨质疏松。综上所述,OA的发生与中性粒细胞的发生密切相关,同时BMSCs从多个方面减轻中性粒细胞对软骨细胞的损伤,并通过其多向分化潜力促进软骨的修复。

OA一直被认为是一种软骨退行性疾病,但炎性反应在其发病机制中起着至关重要的作用,由炎性激活的先天性免疫受体(也称为危险信号)引发软骨细胞变性,BMSCs可通过Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)发挥其大部分功能,TLRs是由2个结构域组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白,其一是富含亮氨酸重复序列(leucine- rich repeat,LRP)的结构域,用于识别病原体相关的分子形式(pathogen- associated molecular patterns,PAMPs);其二是Toll/IL-1受体(Toll/IL-1 receptor,TIR)结构域,它激活的适配分子包括髓系分化初级反应、TIR结构域受体相关蛋白、TRIF相关适配分子和含有TIR结构域的蛋白诱导干扰素-β[40]。哺乳动物细胞质膜上的TLRs主要是TLR4(主要适应于识别LPS和跨质膜并转发LPS信号),它可以检测微生物细胞表面成分,TLR5识别鞭毛蛋白,TLR1、2和6检测细菌脂蛋白,TLR3专门检测双链RNA(dsRNA),TLR9是一个未甲基化的含CpG的ssDNA的受体,TLR13能识别细菌核糖体RNA,OA患者中,TLR4与BMSCs与其外泌体的作用机制及其信号通路是研究的热点[41]。

在BMSCs成骨、成脂和成软骨诱导下,TLR4的表达增加,TLR4的应力诱导配体(FnIII-1c)在分化早期促进成骨,TLR4基因敲除抑制了成骨和部分软骨生成,并促进了脂肪生成,而在MSCs向成骨细胞分化的早期,脂多糖刺激下TLR4的表达显著增加,然后逐渐下降,但脂多糖可导致成骨细胞TLR2和TLR4表达下调,而内毒素负面调节TLR4的表达,从而影响BMSCs成骨、成脂和成软骨的分化[41-42]。脂多糖结合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein,LBP)和CD14促进了内毒素向TLR4/MD2复合体的转移,内毒素向分子复合体的转变是激活免疫系统所必须的,而TLR4受体复合体的异质性随着TLR4的激活而变化[41,43]。TGF-β1可调节免疫系统,而脂多糖诱导的BMSCs中可增加胶原沉积,进而诱导BMSCs中纤维连接蛋白的沉积增加,这与TGF-β1水平的降低有关[20,26, 41]。因此,作用于配体的时间、配体的类型、分化阶段、TLR刺激途径(内源性或外源性)、配体的浓度、细胞的类型和种类都会影响BMSCs的分化潜能,甚至对OA内在机制的免疫调节也产生重要作用。

3 小结与展望

OA的发病机制不仅涉及软骨损伤和力线改变,还与免疫及炎性反应方面有着密切关系。BMSCs在免疫及炎性反应调节和组织再生方面具有潜力,根据OA的发病机制,结合BMSCs的免疫及炎性反应调节作用,可以提前解决免疫和炎症因素对OA的影响,并联合最新的靶点治疗,作为治疗和预防早中期OA的有效方式,对于中期OA,可以依靠BMSCs的修复能力来治疗损伤的软骨。然而,无论采用何种方式,利用BMSCs治疗OA的方法仍不够成熟,还需要进一步探索和研究BMSCs在防治OA方面的机制,以提供更精准、安全和有效的治疗方案。下一步展望应着重进一步研究OA的发病机制和诱因,以更全面地了解OA的病理过程和影响因素。深入研究BMSCs在免疫及炎性反应调节和组织再生方面的作用机制,以提高其在OA治疗中的效果和安全性。探索和开发更多的靶点治疗方法,结合BMSCs的免疫及炎性反应调节作用,以提供更多个性化的治疗选择。进一步优化和改进利用BMSCs治疗OA的方法,以提高治疗效果和预防并发症的发生。加强临床实践和研究的结合,开展大规模的临床试验,以验证BMSCs治疗OA的安全性和有效性;推动BMSCs治疗OA的临床应用,为患者提供更为精准、安全和有效的治疗方案。