冬虫夏草分子鉴定方法研究进展

潘映秋 洪 亮 王 黎

冬虫夏草为麦角菌科冬虫夏草菌(Ophiocordycepssinensis(Berk.) Sacc.)寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的幼虫尸体及子座的复合体[1]，为国家二级保护名贵药材，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等多种生物学效应[2]。冬虫夏草不仅作为中药材使用，同时还作为保健品用于日常保健，受众面广。但同时野生冬虫夏草环境要求高，资源分布区域受限，人工培植技术尚不成熟，市场需求量大，因此价格节节攀升，供需严重失衡。

由于虫草种类繁多，普通消费者难以识别。不法商家在利益的驱动下，将其他真菌感染所得虫草，如亚香棒虫草、凉山虫草、新疆虫草、蛹虫草等冬虫夏草的易混淆物种作为冬虫夏草出售；更有甚者，用地笋的根茎、地蚕的根茎、面粉等加工为假虫草，投放到市场欺骗消费者[3]。此外，冬虫夏草相关的药品、保健品、营养食品等不断地被开发，受到市场追捧，但在此过程中，经过多道工序的深加工，冬虫夏草已经丧失了其外观特性，无法鉴别，导致市场失序，食药安全隐患重重。因此，特异、灵敏、可靠的冬虫夏草鉴伪方法，对保证冬虫夏草市场流通的规范、食用的安全和治疗的效果尤为重要。

传统的冬虫夏草鉴别多采用性状、显微和化学鉴别。其中性状和显微鉴别，要求检验人员具备丰富的鉴伪经验，主要适合于未经加工破坏的完整虫草的检测，对于加工后丧失冬虫夏草形态的粉末或各种制剂很难进行有效鉴定。化学鉴别主要包括一般理化鉴别、光谱鉴别、色谱鉴别等，影响因素多，比如虫草发育阶段、外部环境的改变等都是潜在的影响因素，因此检测准确性受限[4]。近年来，分子鉴别作为新兴的中药材鉴定手段，通过动植物源性成分核酸分子的特征对其进行鉴别和分类，较传统检验方法灵敏度更高、特异性更好、结果更可靠，在冬虫夏草鉴别中的研究也日益深入，为冬虫夏草的鉴别提供了有力的技术支持和有效的科学补充。目前冬虫夏草分子鉴别的方法主要有DNA测序技术和各类PCR检测技术等。本文对近年来冬虫夏草分子鉴别方法进行综述，供消费者和科技工作者参考。

1 DNA测序技术

冬虫夏草为虫菌结合体，分子鉴定分菌体鉴定和虫体鉴定两部分，因此其DNA测序技术一般包括基于ITS序列的菌体鉴定和基于COI及Cytb序列的虫体鉴定技术。

1.1 基于ITS序列的菌体鉴定冬虫夏草无性型的鉴定在学术界仍无定论，但通过随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)和核糖体内转录间隔区(Nuclear ribosomal DNA internal taranscribed spacer, nrDNA ITS)分子标记等分子鉴定手段，中国被毛孢(Hirsutellasinensis)被认为是冬虫夏草的无性型，其ITS序列也是目前冬虫夏草鉴别研究使用的主流鉴定序列[5]。

ITS序列广泛存在于核糖体DNA中，种内变异小，种间变异大，能够提供系统生物学分析所需的可遗传性状，是非常重要的分类鉴定和系统发育分析的分子标记[6]。因此，多项研究选择虫草ITS通用引物，使用PCR法对该区域序列进行扩增，并进一步进行基因测序，通过对高特异性部分序列的比对来区分冬虫夏草及其伪品的基原。如Xiang等[7]应用ITS序列的差异，分析了冬虫夏草、下垂虫草、古尼虫草在内的多种虫草ITS的DNA条形码，证实通过ITS序列差异可鉴别相关虫草。马红梅等[8]对青海冬虫夏草和新疆虫草进行了DNA条形码鉴别，分别选择ITS序列和18S序列开展比对分析，结果发现ITS序列较18S序列更适合鉴定区分冬虫夏草和新疆虫草。苏燕燕等[9]选择了ITS特异性引物，对冬虫夏草、凉山虫草、古尼虫草、新疆虫草、金蝉花和下垂虫草等开展DNA序列分析，结果表明ITS可实现虫草的鉴伪。

1.2 基于COI及Cytb序列的虫体鉴定线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列和线粒体内膜中细胞色素b氧化酶基因的亚基(Cytb)已广泛应用于昆虫遗传进化、系统发育等方面的研究[10]。通过对虫草属COI序列和Cytb序列的条形码分析，可对虫草类寄主昆虫的物种进行鉴定。陈抒云等[10]通过对冬虫夏草、凉山虫草、亚香棒虫草和戴氏虫草等物种的寄主昆虫的COI 序列和Cytb 序列的条形码分析，发现COI 序列和Cytb 序列都能很好地区分鉴定虫草类各物种，但COI 序列的简约信息点多于Cytb，同时基因变异率更低，因此更适用于虫草中寄主昆虫的鉴定。苏燕燕等[9]在ITS序列对虫草菌体进行鉴别的同时，结合COI特异性引物，对冬虫夏草、凉山虫草、古尼虫草、新疆虫草、金蝉花和下垂虫草开展COI DNA序列分析，结果表明COI区可实现虫草的虫体鉴伪。

2 PCR检测技术

尽管DNA序列分析可以准确鉴定虫草并对其进行聚类区分，但其检测过程涉及了PCR扩增、电泳检测、PCR产物纯化、PCR扩增片段测序、测序结果拼接及序列比对分析等一系列步骤，操作繁琐，专业度高，不适用于快速检验及基层检验的推广应用。因此，基于冬虫夏草DNA条形码中的特异性片段，已有多项研究开发了不同的PCR法直接对冬虫夏草进行鉴别。

2.1 特异性PCR法特异性PCR主要通过筛选针对冬虫夏草ITS区的特异性序列引物，对样品开展冬虫夏草特异性PCR扩增，继而采用凝胶电泳成像鉴别冬虫夏草。张喜库等[11]设计了冬虫夏草ITS1序列的特异性引物，对虫草样品进行特异性扩增，结果冬虫夏草可扩增得到255 bp的目的片段，其余虫草样品未能扩增出相应条带，从而实现对冬虫夏草真伪的鉴别。苏燕燕等[9]则选择2对ITS特异性引物对冬虫夏草ITS区进行特异性扩增，冬虫夏草可得到297 bp和136 bp 2个片段，而伪品则无扩增，可实现冬虫夏草的快速鉴伪。

2.2 双重PCR法由于冬虫夏草为虫菌结合体，因此有研究探索了在同一PCR反应体系内同时检测冬虫夏草菌及其寄主特征性基因核酸片段并结合电泳检测来鉴别冬虫夏草的方法。程池等[12]以冬虫夏草原草粉基因组DNA为模板，应用特异性引物，一次单管双重PCR反应扩增冬虫夏草菌种及其宿主蝠蛾的特征性基因，可同时鉴定冬虫夏草菌及其宿主。张富丽等[13]也开发了一种可在同一PCR反应体系中检测虫草菌ITS和宿主COI基因的双重PCR冬虫夏草鉴伪方法。李春红等[14]以寄主昆虫COI基因及冬虫夏草菌rDNA ITS区设计特异引物，成功从冬虫夏草虫体部分扩增出220 bp和146 bp 2条特异性条带，该方法准确率高、稳定性好，能实现快速鉴别冬虫夏草真伪。

2.3 环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)通过应用特异性靶序列的LAMP引物，实现对冬虫夏草的特异性扩增，不需要进行凝胶电泳检测，可更快捷地检出冬虫夏草。李奎等[15]针对冬虫夏草CSP2基因设计LAMP内外引物对，结合Taq1酶切鉴定和荧光染料显色系统，建立可快速鉴定冬虫夏草的检测方法。侯飞侠等[16]则在冬虫夏草特异性PCR检测方法的基础上，以体外诊断试剂评价标准开发了冬虫夏草LAMP快速检测试剂盒，检测结果显示冬虫夏草质量占混合物质量的1/200(质量分数0.5%以上)以上时可被成功检测，且仅有冬虫夏草可被成功扩增，并在紫外灯下显示绿色荧光，该方法有望推广应用于市售冬虫夏草及其伪品的检测。

2.4 荧光PCR法特异性PCR和双重PCR法都需要通过对PCR产物进行凝胶电泳确认，操作时间相对较长，存在被PCR产物片段污染的隐患，且无法避免一代PCR对低丰度模板DNA扩增的假阴性结果，此外对经加工处理后DNA分子降解的冬虫夏草模板的检测灵敏度也存在一定的局限性，检测效率低。而LAMP检测虽然简便快速，但受限于方法学，存在一定的假阳性，适合作为初筛，不适合作为最终的确证。

实时荧光PCR作为二代PCR技术，在PCR反应体系中引入荧光染料或荧光标记的特异性探针，边开展PCR扩增边收集荧光信号，通过荧光信号的改变来分析扩增结果，不需要后续开盖操作，速度更快、灵敏度更高、污染更小。马骏等[5]针对冬虫夏草ITS区设计了特异引物及探针，检测速度快、检测特异性高，对冬虫夏草DNA模版的检测灵敏度可达0.0001 ng/μl，并在此基础上将该方法开发成为SN/T 3957—2014 《冬虫夏草真伪鉴别实时荧光PCR方法》[17]，作为中华人民共和国出入境检验检疫行业标准，推荐用于冬虫夏草天然原料及其发酵菌丝体的鉴定。宋经元等[18]也建立了用于快速鉴别冬虫夏草及其伪品的荧光定量PCR检测法，筛选特异性引物和Taqman探针，对冬虫夏草药材、含冬虫夏草的成方制剂及其他相关产品进行了真伪鉴定。

2.5 数字PCR法实时荧光PCR提高了冬虫夏草鉴伪的效率和灵敏度，但仍存在一定问题，包括其检测限量低至0.0001 ng/μl，在保存过程中沾染冬虫夏草粉末的伪品同样可以检出冬虫夏草阳性结果，存在假阳性的隐患，且无法检出掺伪品；此外荧光PCR检测可以通过荧光信号反映本底的含量，但考虑到PCR扩增效率的不一致，其定量过程必须引入标准曲线，属于相对定量，需要使用统一标准的冬虫夏草标准品，而引发的新问题是如何对冬虫夏草标准品进行规范和质量控制，目前尚无法解决。由此可见，目前冬虫夏草的鉴别方法均不能快速有效地对冬虫夏草的掺伪品进行检测。

数字PCR作为第三代PCR技术，不需内参基因和标准曲线，可实现绝对定量分析，具有良好的准确度和重现性，对干扰因素较多的样品检测准确率和灵敏度都高于荧光定量PCR[19]。目前dPCR技术可以分为微滴式(droplet dPCR，ddPCR)和芯片式(chip dPCR，cdPCR)2种，均可达到相近的检测效果。目前已应用于病毒载量的绝对定量检测、罕见基因突变检测以及动物源性、植物源性食品的掺伪检测等方面，其在食品药品安全检测领域的应用越来越广泛[20,21]，该技术也为冬虫夏草绝对定量检测方法的建立提供了新平台。闫邦奇等[22]探索了微滴式数字PCR定量检测冬虫夏草的可行性，通过选择冬虫夏草ITS的特异性引物和探针，能够对冬虫夏草进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。但该研究主要针对冬虫夏草菌丝体ITS进行定量检测，其寄主虫体因素对其定量的影响及数字PCR应用于冬虫夏草相关制剂定量检测的可行性仍有待进一步研究探讨。

3 小结和展望

冬虫夏草作为名贵的中药材，在国内市场上具有极其重要的药用价值和经济价值，但冬虫夏草市场复杂、掺伪品种来源多样，因方法学限制，市场监管存在漏洞，亟需建立特异性高、灵敏度高、稳定可靠的鉴伪方法。

分子鉴定以其特异、灵敏、准确的优势，为冬虫夏草的准确鉴伪提供了可能。如上所述，近年来，已有大量研究团队探索了多种分子检测技术鉴定冬虫夏草真伪的可行性：LAMP为冬虫夏草的现场鉴伪提供可能；荧光PCR已经作为行业标准应用于冬虫夏草的鉴伪检测；DNA基因测序则可更为准确地反馈不同虫草之间的核酸差异，为冬虫夏草的鉴定和分类提供技术支持；数字PCR作为定量检测技术，则为冬虫夏草的定量检测提供了新的思路。但针对冬虫夏草制剂产品的鉴伪研究还较少，有待进一步深入探讨。

随着现代分子检测技术的不断革新，新技术新平台不断开发，可包括冬虫夏草在内的多种动植物源性成分的食品药品鉴伪和定量检测提供更多选择，也将为相关食品药品的质量评价提供更全面、更多维度的评价指标。