美洲狼尾草组织培养再生体系的建立

范欲航，许 悦，祝诗词，王净洁，贾纪原，黄琳凯

(四川农业大学草业科技学院，四川 成都 610000)

美洲狼尾草(Pennisetumglaucum)，一年生禾本科植物，又名珍珠粟、御谷，是一种优质的牧草资源，其原产地位于非洲中部热带地区，具有生长速度快、茎叶产量高、营养成分丰富、适应性广、家畜适口性好、抗旱能力强、抗逆性高等特点，非常适合在高温、干旱、盐碱的地区种植[1]。美洲狼尾草的价值主要体现在作为粮食作物、饲草作物生产和能源牧草利用等方面，世界范围内均有相关记载其在粮饲领域中的作用，例如撒哈拉沙漠以南和印度次大陆以北的干旱贫困地区以美洲狼尾草的籽实作为主要口粮，种植面积达到3 100万公顷[2-3]；北美洲与澳洲部分干旱地区将美洲狼尾草制成青贮饲料喂养家畜[4];在我国北起黑龙江、南至海南的一定区域内也引进了美洲狼尾草进行牧草生产[5];在张建丽等人的研究中发现狼尾草属的作物具有高效生产乙醇的能力，可开发作为能源作物[6]。

我国美洲狼尾草的育种研究仍处于起步阶段，相较于传统的育种方式，结合转基因的现代育种更能促进该牧草作物在我国的发展。现代分子育种在主要粮食作物与牧草作物上的应用已经相对成熟，例如抗除草剂小麦、抗虫害玉米和抗叶斑病苜蓿等优良转基因品种的创制[7-9]，而大部分的转基因工作基于组培再生体系的构建，所以构建美洲狼尾草组培再生体系对于该牧草的育种工作具有很大意义。

以往的研究通常使用植物的器官、组织、胚胎或细胞进行离体培养，在给予一定的培养条件后可以促使外植体再生为愈伤组织和丛生芽，最终形成完整的植株，这依赖于植物的全能性[10]，而在培养过程中需要考虑污染、诱导和分化三个因素[11-12]，其中污染问题是需要最优先解决的，因为微生物在培养基中产生的霉变、毛囊状、浑浊的污染痕迹会影响组培材料的良好保存与进一步生长[11]，所以通常采用例如NaClO、乙醇等杀菌剂清理外植体，减少污染状况。愈伤组织的诱导与分化是外植体完成再生的两个重要过程，由外植体被诱导形成愈伤组织再由愈伤组织分化形成丛生芽，外源激素在培养基中的组合与浓度搭配是促进诱导与分化的关键[12]，生长素类型的植物激素对愈伤组织细胞的分裂具有明显促进作用，同时在细胞分裂素/生长素比例较高时会促进丛生芽的生长[12]。本试验通过不同消毒方式与多种激素组合对美洲狼尾草的几种外植体进行处理，探究由外植体发育为再生植株的有效方式，构建美洲狼尾草的组培再生体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为美洲狼尾草‘斗牛’的种胚、幼叶、幼穗和茎节，外植体材料均采自四川农业大学崇州试验基地；种胚的收获时间为2021年7月中旬，4℃低温干燥贮存，幼叶、幼穗和茎节的采集时间为2021年7月至8月。

1.2 试验方法

1.2.1外植体的选择与消毒处理 本试验以美洲狼尾草的种子、幼叶、幼穗、茎节为外植体。挑选成熟且颗粒饱满的美洲狼尾草种子，用清水冲洗30 min备用；将出苗3-4天的美洲狼尾草子叶切割为长宽约2 mm的小段备用；将灌浆期的美洲狼尾草幼穗切下并分割为长度约5 mm的小节备用；将美洲狼尾草节上分生区的组织切割为长宽高约2 mm的颗粒备用；对所有外植体均使用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗5次，再分别用升汞(0.1%HgCl2)与3%，5%，7%NaClO浸泡一段时间，时间设置为5 min，10 min，15 min，继续用无菌水冲洗5次。消毒完成后即可接种于诱导培养基中诱导愈伤组织。

1.2.2愈伤组织的诱导 将不同外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基配方为MS+2,4-D(1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，3.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1，5.0 mg·L-1)+6-KT(0.1 mg·L-1，0.5 mg·L-1，1 mg·L-1，2 mg·L-1，4 mg·L-1)+6-BA(0.1 mg·L-1，0.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH=5.8，121℃灭菌20 min，每份培养基接种外植体15粒，设置三种植物激素的浓度梯度并做5个重复，找出诱导率最高的激素配比。在诱导培养基中每培养14 d进行一次继代，继代两次后将愈伤组织转移至分化培养基中。

1.2.3愈伤组织的分化 将愈伤组织转移至分化培养基之前需要切除原本的外植体部位，只转移愈伤块，分化培养基配方为MS+6-BA(1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，3.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1，5.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1，1.5 mg·L-1，2.0 mg·L-1，2.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH值为5.8，每份培养基接种愈伤块10粒，设置两种植物激素的浓度梯度并做5个重复，找出再生率最高的激素配比。在诱导培养基中每14 d进行一次继代，直至再生苗生长高度达到5 cm以后转入生根培养基中生根。

1.2.4生根与再生植株的移栽 生根培养基配方为1/2MS+3%蔗糖+1%琼脂，生根培养基中培养20天后移栽至混合土(营养土∶蛭石=2∶1)中完成再生。

1.2.5评价指标 外植体污染率=污染的外植体数量/外植体接种数量×100%；

愈伤组织诱导率=愈伤组织数量/(外植体接种数量污染的外植体数量)×100%；

愈伤组织分化率=愈伤组织再生数量/愈伤组织接种数量×100%。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式对外植体污染的影响

结果表明，消毒过后的污染率都有所下降，其中种子在不同消毒方式处理后的污染率具有显著差异。如表1所示，随着消毒液浓度和消毒时间的增加，大多数外植体的污染率会随之降低，相较于种子和幼叶，幼穗和茎节外植体经过高浓度与长时间的消毒液浸泡仍然有较高的污染率，其中种子在5%和7%的次氯酸钠中消毒5～15 min，其污染率降低为1.33%，在升汞中消毒15 min能够将污染率降低至0；幼叶、幼穗和茎节外植体最佳的消毒方式为升汞消毒10～15 min，其中幼叶在升汞中消毒10 min能够将污染率降低至0。

表1 几种外植体在不同消毒方式下的污染率

2.2 不同消毒方式对种子发芽率的影响

在培养过程中我们发现种子的发芽率会影响其诱导率，于是在进一步的工作中测量了不同消毒方式对发芽率的影响。结果表明，高浓度的消毒试剂会明显降低种子的发芽率，其中升汞处理10～15 min与NaClO处理10～15 min后种子的发芽率具有显著差异。如表1所示，5%，7%次氯酸钠与升汞消毒都可有效降低外植体在培养基中的污染率，虽然升汞消毒15 min能够将污染率降低至0，但是会影响种子的发芽率，如表2所示，升汞消毒15 min后发芽率降低至26.67%。而5%次氯酸钠消毒种子5 min后在保持较低污染率的同时又具有较高的发芽率，其发芽率为86.67%。

表2 不同消毒方式对种子发芽率的影响

2.3 不同诱导培养基激素配比对愈伤组织诱导的影响

污染问题使我们放弃了幼穗诱导愈伤组织的工作，在此阶段对种子、幼叶与茎节进行培养。结果表明，不同植物激素对愈伤组织的诱导率具有显著差异，如表3所示，在诱导培养基中添加3 mg·L-12,4-D+1 mg·L-16-KT种子外植体的诱导率最高，达到93.33%，同时发现添加0.1 mg·L-16-BA后愈伤组织的最高诱导率没有明显变化，诱导率仍然为93.33%，但是愈伤组织的颜色由整体的黄褐色转变为黄白色，美洲狼尾草不同颜色的愈伤组织如图1所示。幼叶与茎节的诱导率为0(在多种激素组合中均为0，未放于图中)，如图2所示，诱导培养基中培养了30 d后的幼叶、茎节均无愈伤组织的形成。得出结论以种子为外植体可高效诱导愈伤组织的形成。

图1 诱导培养基培养30 d后愈伤组织呈现的4种不同颜色

图2 诱导培养基培养30 d后愈伤组织的诱导情况

表3 不同浓度6-BA，6-KT与2,4-D组合对种子愈伤组织诱导率的影响

2.4 不同分化培养基激素配比对愈伤组织分化的影响

愈伤组织于诱导培养基中培养42 d(2次继代)后，于无菌工作台中剪去原生的胚芽与胚根，然后接种至分化培养基中，如表4所示，在分化培养基中加入1 mg·L-1NAA，3 mg·L-16-BA愈伤组织的分化率最高，其分化率为81%。分化率的评判标准为产生再生苗的愈伤组织数量，如图3 d所示，再生苗由愈伤组织切去原生胚芽附近的胚性愈伤组织产生，胚性愈伤组织的颜色由黄白色转变为绿色，同时形成不定芽，如图4 d所示，不定芽的生长形态为厚实颜色偏绿的叶片，与原生胚芽细长单薄的叶片不同。如图3e所示，胚性愈伤组织经过分化培养基培育21 d后形成了密集的再生芽丛。

表4 不同浓度NAA与6-BA组合对愈伤组织分化的影响

图3 美洲狼尾草愈伤组织分化再生过程

2.5 再生苗的生根与移栽

如图3f所示，将分化21 d后的芽丛接种到1/2MS生根培养基中再培养20 d即可移土栽培，如图3 h所示，分化形成的丛生芽发育形成了一簇茂盛的美洲狼尾草株系，完成了由愈伤组织再生为完整植株的过程。

3 讨论

3.1 外植体的选择与消毒处理

据报道，外植体的生理状态、再生功能不同将影响愈伤组织的形成[13]，而在许多双子叶植物的外植体再生研究中，为了验证植物的全能性，通常以植物的器官诱导愈伤组织，例如烟草(Nicotianatabacum)的组织培养选用叶片为外植体[14]，建立番茄(Lycopersiconesculentum)的再生体系选用茎段为外植体[15]。在外植体的选择上单子叶植物与双子叶植物有一定差别，禾本科在构建组培再生体系时常常选用种子、幼穗作为外植体，例如鸭茅(Dactylisglomerata)以幼穗为外植体，柳枝稷(Panicumvirgatum)以种子、幼穗为外植体均成功诱导出胚性愈伤组织并形成再生苗[16-19]，这或许与单子叶植物器官的分化程度有关，较高的分化程度会增加器官脱分化的难度，所以需要选用具有一定胚性的外植体来构建其再生体系，本试验选用具有一定胚性的外植体种胚、幼穗与胚性较弱的幼叶和茎段作为外植体，初步验证了美洲狼尾草在构建组培体系时需要依靠外植体本身的胚性。

在消毒过程中发现种子的消毒效果比较好，NaClO与升汞处理后都可有效的降低污染率，但是结合两种消毒方式对种子发芽率的影响，最终选择5%NaClO消毒5 min的消毒方式，而在其他外植体中升汞的消毒效果要明显高于NaClO，但是并未探索到对于其他外植体诱导愈伤组织的有效方法，所以对于升汞对其他外植体的诱导过程是否有影响还需要进一步的研究与验证。

3.2 不同激素配比对种子愈伤组织诱导的影响

2,4-D是一种生长素类似物，常常作为组织培养中愈伤组织诱导的外源激素，在诱导外植体脱分化的过程中环境内的生长素与细胞分裂素比例升高会促进外植体的脱分化并形成愈伤组织[20]，以2,4-D为单一变量在仅有这一种外源激素的诱导培养基中筛选出诱导率相对较高的激素配比即3 mg·L-1，其诱导率为 44%。通过筛选出单一变量的最佳效果，并在此基础上添加其他植物激素进行优化可以增加筛选效率并降低工作难度。KT是一种天然植物内源激素，外源添加可以发挥细胞分裂素的性能，可以调节培养基内生长素与细胞分裂素的比值进而影响外植体的脱分化，在许多组织培养体系中常使用2,4-D与KT搭配来诱导愈伤组织的形成[20-23]。因此以3 mg·L-12,4-D的MS培养基为基础逐量添加KT来筛选更高诱导率的植物激素配比，试验结果也证实了这种筛选方法，1 mg·L-1KT+3 mg·L-12,4-D的MS培养基其对种胚发育形成愈伤组织的诱导率达到93%，是仅添加2,4-D诱导率的两倍。6-BA是一种人工合成的类细胞分裂素，在组织培养中可以起到提高愈伤质量与增加诱导率的作用，所以进一步的以1 mg·L-1KT+3 mg·L-12,4-D的MS培养基为基础逐量添加6-BA，我们观察到在加入0.1 mg·L-16-BA中愈伤组织的整体颜色由黄褐色转变为黄白色，这减缓了愈伤组织的褐化速度，加入6-BA后并没有明显增加诱导率但是提高了胚性愈伤组织分化前的愈伤质量，更利于再生苗的分化。

在整个试验过程中我们发现单一的外源激素2,4-D其实并不能达到很好的诱导效果，而在逐步添加激动素KT后愈伤组织的诱导率明显增加，这体现了不同类型的外源激素搭配在愈伤组织的形成过程中发挥着重要作用。针对于狼尾草属作物的组培研究，或许可以参考以上方法尝试添加多种激素类型的组合，例如添加激动素、细胞分裂素等配合生长素共同促进愈伤组织的形成，能够有效的找出不同品种狼尾草属作物的组培方式。

3.3 不同激素配比对胚性愈伤组织分化的影响

在诱导愈伤组织分化的过程中需要促进植物细胞的再分化，因为细胞分裂素可以促进愈伤组织向再生植株的方向发展[22]，所以需要使得培养基内细胞分裂素的比值高于生长素，6-BA与6-KT均为细胞分裂素类型的植物激素，但是相较而言6-BA具有诱导不定根与不定芽的能力[24-25]，所以采用6-BA作为外源激素来增加分化环境内细胞分裂素的含量。在仅加入3 mg·L-16-BA的MS培养基愈伤组织的分化率明显增加，分化率达到55%，是空白组分化率的10倍。NAA是一种人工合成的类生长素类物质，在许多组培分化试验中常常作为促进分化的植物激素来添加，在本试验中以3 mg·L-16-BA的MS培养基为基础逐量添加NAA，筛选出分化率较高的激素配比，最终试验结果显示3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA的MS培养基对胚性愈伤组织分化形成再生苗的分化率影响最大，分化率达到81.4%。

因为分化试验使用的胚性愈伤组织是以美洲狼尾草的种胚诱导形成的，而种胚本身会发育原生的胚芽与胚根，所以在分化阶段为了区分原胚芽与再生的不定芽需要在接种前切去原生胚芽与胚根，成功分化的胚性愈伤组织会形成密集的不定芽芽丛，这些芽丛呈现为颜色深绿叶片厚实的形态，每个芽丛发育后可形成15-25株美洲狼尾草个体，此外我们发现在不添加外源激素的MS培养基中胚性愈伤组织原生胚芽的部位会继续延伸，这样形成的再生植株不会产生不定芽的芽丛，可视为由原生胚芽发育而来的植株，不计入分化再生数量。本试验中选用1/2MS培养基作为生根培养基,并未添加额外的添加物来促进生根,一方面是因为1/2MS本身具有促进植物生根的能力,另一方面是美洲狼尾草的生根能力比较强[26-28]。

综上通过选用的种子外植体，我们诱导出了美洲狼尾草的胚性愈伤组织，并促使此愈伤组织分化成为可自然生长的植株，在此过程中产生的愈伤组织材料和丛生芽对于美洲狼尾草的遗传转化研究与育种扩繁建立了基本体系。

4 结论

美洲狼尾草‘斗牛’能够以种胚为外植体进行组织培养再生并形成再生植株，使用5%NaClO消毒 5 min可降低污染率同时保证发芽率不受消毒液影响，污染率为 1.33%，发芽率为86.67%，以MS+3 mg·L-12,4-D+1 mg·L-16-KT+0.1 mg·L-16-BA作为愈伤组织诱导培养基可高效诱导愈伤组织的形成，诱导率为93.3%，以MS+3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA可促进美洲狼尾草胚性愈伤组织的分化，分化率为81.4%。