高寒草甸土壤细菌群落多样性和共现性网络对牦牛觅食强度的响应

孟令旭，贾彩玲，许春雪，张潇文，呼 和

(内蒙古大学生态与环境学院，内蒙古 呼和浩特 010000)

微生物是生态系统的重要组成成分，能够广泛参与生态系统的物质循环和能量流动等过程[1]。细菌群落对草地生态系统中土壤养分存储和植物生长等过程起到了重要作用[2]。此外，细菌群落通常对环境变化比较敏感，能够对植被和土壤等环境因素变化迅速作出响应，因此经常被用来指示生态系统变化[3]。

动物觅食能够通过采食、践踏和排泄等行为改变土壤理化性质，从而影响土壤细菌群落[4]。研究表明，动物采食通过影响地上植被来改变土壤碳和氮的分配[5]；践踏能够改变土壤孔隙度以及水的导流能力；动物排泄导致的粪便沉积通过循环利用营养物质，改变了土壤氮含量[4]。这些土壤性质的改变严重影响了土壤细菌群落。以往动物觅食对生态系统影响的研究大多集中在地上植物群落[6-7]。例如，荒漠草原放牧通过降低植物多样性，调节生态系统功能[8]，降低草原生态系统的生产力[9]；半干旱草原放牧通过改变植物特征，从而保护生物多样性并提高植物群落恢复力[10]；高寒草原放牧通过影响植物多样性来调控草地生产力的分配[11]。然而，细菌对调控生态系统的稳定性等方面同样有着重要作用[12]，如，农业生态系统稳定性[13]和荒漠生物结皮的稳定性[14]。此外，Xun等[15]研究表明细菌群落维持了土壤氮代谢和磷酸盐代谢等功能，有利于改善生态系统服务功能。细菌在生态系统中通常不会以单一个体的形式存在，他们之间存在竞争或互利共生等相互作用。微生物类群间相互作用不仅能够影响土壤碳矿化速率[16]，还对土壤甲烷循环等生态功能起到了重要作用[17]。Cameron等[18]研究表明土壤细菌类群间相互作用对维持草地生态系统的多功能性起到了重要作用。越来越多研究表明，共现性网络是研究微生物类群间相互作用的重要手段[19-20]。共现性网络不仅能够反映物种间复杂的相互作用，还能够更好的预测生态功能多样性[21]。然而，我们对于动物觅食行为导致的高寒草甸土壤细菌多样性和共生模式的改变及其调控因子的认识还不足。

青藏高原是亚欧大陆最大的地貌单元，其草地面积约占全国草地总面积的三分之一，对全球气候变化调节、水源涵养和生态系统服务功能等方面具有重要作用[22-23]。此外，青藏高原生态系统比较脆弱，容易受到气候变化和人为等因素影响[24]，动物觅食则是影响青藏高原生态系统的一个关键因素。本文通过对牦牛不同觅食强度下土壤理化性质和细菌群落的变化进行分析，探究青藏高原高寒草甸土壤细菌群落组成、多样性和共现性网络对牦牛觅食的响应特征，明确不同觅食强度下土壤理化因子的变化规律以及对细菌群落产生的影响，以评估生态系统的变化过程，这对青藏高原的合理利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 研究区域和实验设计

研究场地位于青藏高原东缘的甘肃省甘南州玛曲县中部阿孜畜牧科技示范园区(33°40′ N，101°52′ E)，该地区海拔3 650 m，主要土壤类型为亚高山草甸土，草地类型属于典型高寒草甸草原，气候为高原大陆性季风气候，年均气温1.2℃，年均降水量620 mm，主要集中在5—9月，年日照时间约2 580 h，年平均霜日大于270 d，没有四季，只有冷暖季之分。牧草每年5月初开始返青，9月开始逐渐枯黄。

2009年开始，在甘南玛曲阿孜畜牧科技示范园区附近选择放牧草地做为样地，长期以来，该样地都以自由放牧为主，且放牧时间和管理模式相同。综合之前的研究方法[25]，为了减少牦牛觅食距离造成的实验误差，根据草地到牛圈的距离、牦牛的行走路径、牦牛理论采食量、采食时间、样地面积和对应的牦牛数量将其划分为4个不同觅食强度梯度，本实验设计还充分考虑了牦牛行为和放牧时长等因素，依次选取距离牛圈入口250 m，500 m和1 000 m的区域分别作为重度觅食(HFI)、中度觅食(MFI)和轻度觅食(LFI)的采样区域[25]，围封1个禁止采食区域作为对照(CK)(图1)。相对放牧强度(yak units·hm-2)=牧户存栏数/不同梯度区域面积(不同半径的同心圆面积)[25-26]，计算得到CK，LFI，MFI和HFI的觅食强度分别为0，2.6，3.5和6.5 yak units·hm-2，牦牛每天采食时间为8 h。

图1 实验设计示意图

1.2 样品采集及处理

1.3 土壤理化性质测定

1.4 DNA提取和高通量测序

根据制造商说明，使用土壤FastDNA试剂盒(MP Biomedical，Carlsbad，CA，USA)从0.5 g土壤中提取DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA质量。使用细菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACCAGGGTATCTA-3′)完成细菌16S rRNA基因V3-V4区段序列扩增，扩增产物按照AxyPrep DNA(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)凝胶提取试剂盒说明书纯化。最后使用Illumina Miseq平台测序，去除不明确的碱基和低质量序列，最终碱基平均质量分数不能小于25，碱基序列长度不能低于200 bp，以97%的序列相似性将高质量的序列聚类定义为操作分类单元(OTUs)。

1.5 共现性网络构建

OTU相对丰度被用来构建不同觅食强度下的共现性网络，选取每个处理中至少3个样本同时出现的OTU进行网络分析。我们使用基于3个测量值的集成方法，包括Spearman相关性和OTU两两之间的Bray-Curtis和Jaccard差异，当相关阈值|r|大于0.6且P值小于0.01时，共现性网络被认为是类群之间统计上稳健的相关[27]。利用Brown方法对3种统计值进行合并，然后利用FDR方法对P值进行校正以减少获得假阳性结果的机会[27-28]。最终使用Gephi 0.9.2(https://gephi.org)进行网络可视化。

1.6 统计分析

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

表1 不同觅食强度的土壤理化性质的ANOVA检验

2.2 土壤细菌群落组成

根据不同觅食强度下细菌的OTU数量绘制韦恩图，由图2可知，不同觅食强度处理下共检测到3 427个细菌OTUs，CK，LFI，MFI和HFI特有的细菌OTU数分别为261，331，291和573个，可见牦牛觅食增加了土壤中特有的微生物群落。

高寒草甸草原牦牛不同觅食强度下细菌菌门组成相同，然而丰度不同。门水平相对丰度高于1%的细菌依次为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，其中变形菌门、放线菌门相对丰度最高，分别为30.66%～33.38%和25.04%～28.99%，2者共占土壤细菌总reads数的50%以上(图2)。利用Kruskal Wallis对不同牦牛觅食强度下土壤细菌门水平的相对丰度进行差异显著性检验，结果表明只有疣微菌门(2.46%～5.10%)和芽单胞菌门(1.91%～2.68%)存在显著差异(P<0.05)。

图2 土壤细菌OTUs数量的韦恩图和不同觅食强度细菌门水平物种组成的变化

2.3 土壤细菌群落alpha和beta多样性

群落多样性揭示了牦牛不同觅食强度下细菌群落的分布模式。不同觅食强度下土壤细菌Shannon-wiener多样性指数和chao1指数均无显著性差异(图3)，表明牦牛觅食强度对土壤细菌alpha多样性影响较小。

基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)揭示了牦牛不同觅食强度下细菌群落的分布模式(图3)。非参数的多元方差分析(PERMANOVA)表明，牦牛觅食显著改变了细菌群落组成(P<0.05)，其中，CK和HFI的细菌群落组成均与MFI呈现出显著差异(P<0.05)。

图3 不同觅食强度细菌群落的alpha多样性和beta多样性

2.4 土壤细菌共现性网络

为了研究不同觅食强度下细菌潜在的相互作用以及共发生模式，本研究基于随机矩阵理论，采用相同的阈值(R>0.6，P<0.01)，使用4种觅食强度下的细菌群落分别构建分子生态网络(图4a)。对各共现性网络的节点数量进行统计发现，变形菌门(Proteobacteria)(27.13%～35.09%)、放线菌门(Actinobacteria)(21.81%～24.91%)和酸杆菌门(Acidobacteria)(15.43%～17.67%)是4个网络中的优势菌门(图4a)。牦牛觅食能够增加网络中疣微菌门(Verrucomicrobia)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的节点数量。其中，随着共现性网络中疣微菌门相对丰度的增加，细菌群落beta多样性及网络复杂度降低(图4b)。

图4 不同觅食强度对细菌共现性网络及细菌群落多样性的影响

牦牛觅食强度能够显著改变细菌共现性网络的节点和边的数量以及连接度等多种网络属性(表2)。网络中节点、边和度能够代表网络的复杂度，随着牦牛觅食强度增加，网络节点、边的数量和连接度均呈现先减少后增加的趋势，说明牦牛觅食能够增强网络复杂度。无论觅食强度如何改变，细菌共现性网络节点之间正相关比例均大于负相关。模块化程度和聚类系数反映了网络中节点聚在一起的程度，不同处理中网络模块化程度(0.967～0.984)均很高，表明网络能够通过模块发挥相应功能。CK处理中具有较高的平均聚类系数，因此该处理中网络节点的聚集程度更高。我们使用Kolmogorov-Smirnov检验方法对网络节点、边和度进行差异性检验，结果表明牦牛觅食能够显著改变网络属性(P<0.05)(表3)。无论哪个处理，两两网络之间的属性均具有显著差异(P<0.05)，说明牦牛觅食能够对细菌共现性网络产生重要影响。

表2 细菌共现性网络属性

表3 共现性网络属性的Kolmogorov-Smirnov检验

2.5 影响土壤细菌群落的主要因子

为了确定牦牛觅食过程中对细菌群落特征变化发挥主要作用的环境因子，用细菌群落的Bray-Curtis距离矩阵与土壤理化参数的欧式距离矩阵进行Mantel test相关性检验，如图5所示，pH值为影响细菌群落最显著的环境因子(P<0.01)。此外，基于细菌OTU的Bray-Curtis相异度矩阵和细菌共现性网络的度分别与pH值变化进行线性回归分析(图6)。结果表明，随着土壤pH值的升高，细菌群落组成(P<0.001)和共现性网络复杂度(P<0.05)都显著增加，进一步验证了上述结果。

图5 细菌群落与理化性质的相关性

图6 细菌群落的Bray-Curtis相异度和共现性网络与pH之间的线性回归

3 讨论

牦牛觅食行为扩大了细菌共现性网络规模，增强了物种间的相互作用，提高了网络复杂度。网络复杂度的增加会导致网络更加稳定，从而抵抗外界环境变化[43]。这可能与牦牛觅食过程中产生的排泄物有关。草地生态系统中，牲畜排泄物排泄到地表后，通过降水、践踏和粪食性动物活动等作用进入土壤，造成土壤物理和化学等性质的改变，从而改变土壤微生物群落[44]。吴宪等[45]同样表明向土壤中施用外源添加剂能够扩大土壤共现性网络规模，提高网络复杂度与稳定性。属于疣微菌门的节点受牦牛觅食干扰而增加，暗示着疣微菌门类群可能通过其它类群之间的相互作用调控高寒草甸土壤氮循环。此外，牦牛觅食行为增加了细菌类群之间正相关关系，表明适当的牦牛觅食行为能够增强细菌类群间的协同作用，协同作用增强有利于形成更多营养级，使土壤养分利用更高效，从而能够提高细菌群落物质循环、能量流动和信息传递的能力[46]。此外，牦牛觅食干扰导致共现性网络平均聚类系数降低，意味着觅食干扰能够增加土壤异质性，从而满足不同生态位细菌的生长[47]，而CK中较高的平均聚类系数代表土壤细菌功能的高度一致性。因此，合适的觅食强度有利于扩大网络规模，提高网络复杂性与稳定性，促使共现性网络发挥更多的功能来适应外界环境变化。

我们发现土壤pH值是影响高寒草甸生态系统土壤细菌群落的主要因子。有研究表明，pH值的变化能够改变土壤酶活性和离子浓度等特征，从而影响硝化和反硝化等功能细菌的代谢活性[48]。此外，土壤细菌类群更偏好偏碱性土壤，pH值升高能够增加碳矿化和产甲烷等功能细菌的相对丰度[49]。我们发现，pH值升高引起细菌群落组成和共现性网络复杂度显著增加，从而可能影响高寒草甸土壤生态系统功能[50]。

4 结论

在高寒草甸，牦牛觅食改变了土壤细菌群落组成，显著提高了疣微菌门(Verrucomicrobia)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的丰度。牦牛觅食干扰主要通过改变土壤pH值影响细菌群落组成，从而提高共现性网络复杂度与稳定性。因此，适度的牦牛觅食干扰对改善高寒草甸土壤生态系统的可持续利用不可忽视。