甘草查尔酮胶囊质量标准研究*

孙 宇，贾智超，张 娟，徐晓琴，卿德刚△

1 新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；

2 乌鲁木齐市中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000

胀果甘草（Glycyrrhiza inflataBatal.）为多年生草本，具有重要的药用价值，近年研究表明，甘草查尔酮类化合物为胀果甘草特色化合物，在其他种类甘草如乌拉尔甘草、光果甘草中未见含有或含量较少［1-5］。甘草查尔酮类化合物不仅具有抑菌、抗真菌、抗氧化活性，其对HIV病毒和某些癌细胞的抑制作用甚至超过了甘草三萜类物质；甘草查尔酮也具有抑制癌细胞生长作用［6-8］。本研究在承担国家自然科学基金项目已完成甘草查尔酮提取工艺研究及治疗溃疡性结肠炎药理药效实验的基础上，进一步对甘草查尔酮提取物的胶囊制剂进行质量标准研究。近年使用发现，仅参照药典标准（含量测定为甘草苷和甘草酸铵）不便于区分各种甘草，有时会导致使用过程中出现质量差异性问题［9-10］，尤其在甘草黄酮或查尔酮类制品的鉴别及含量测定方面。本研究以前期进行的胀果甘草化学成分分离为基础，筛选特征性成分并建立甘草查尔酮胶囊薄层鉴别及含量测定方法，以期为甘草查尔酮胶囊质量控制提供依据，为甘草查尔酮类物质的新药研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器Waters e2695高效液相色谱仪；Waters 2998PDA检测器；色谱柱：Waters XTerra RP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Mettler AE163电子天平；KQ3200型超声波清洗仪；乙腈为色谱纯；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 试药甘草查尔酮A对照品购自上海源叶生物科技有限公司，含量≥98%（CAS号：58749-22-7，批号：20190605001）；甘草查尔酮胶囊供试品3批（20190510、20190511、20190512）及阴性样品（仅由辅料制备而成）均由新疆维吾尔自治区中药民族药研究所提供。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 供试品及对照品溶液制备 取甘草查尔酮胶囊内容物0.02 g，加丙酮10 mL，超声提取15 min，放冷，滤过，提取2次，合并丙酮液，蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取甘草查尔酮A对照品，用甲醇配制成每毫升含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 薄层板活化 将硅胶G薄层板于105 ℃烘箱中干燥30 min，取出放入干燥器中备用。

2.1.3 薄层层析 按照《中华人民共和国药典》2020版四部0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3 μL，对照品溶液3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-异丙醇-甲苯-水-氨水（20∶6∶6∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干。日光下检视后置紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中在对照品相应的位置上显相同斑点，阴性对照无干扰。见图1—2。

图1 甘草查尔酮胶囊薄层色谱图（日光）

图2 甘草查尔酮胶囊薄层色谱图（紫外灯365 nm）

2.2 甘草查尔酮A含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters XTerra RP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-1%磷酸溶液（58∶42）；流速：l.0 mL/min；检测波长：310 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取甘草查尔酮A对照品适量，加甲醇溶解制成每1 mL含2.5 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取甘草查尔酮胶囊内容物约0.85 g精密称定，置具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，精密称重，超声处理30 min，冷却后用甲醇补充减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

图3 甘草查尔酮胶囊及甘草查尔酮A对照品色谱图

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取浓度为2.5 mg/mL的对照品储备液各0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。每次取10 μL依次进样，测定峰面积。以质量浓度（X）为横坐标，色谱峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得甘草查尔酮A回归方程Y=9635.2X+5.8384（r=0.9999）。结果表明甘草查尔酮A在0.05125～0.5125 mg范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，计算得RSD值为0.57%。

2.2.6 重现性试验 取同一批样品6份，制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定含量，结果甘草查尔酮A的平均值为4.4839 mg/g，RSD为1.47%。

2.2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液分别在制备后0、1、2、4、8、12 h时进样测定，测得甘草查尔酮A峰面积RSD为1.54%，表明供试品在12 h内稳定。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的供试品6份，每份0.25 g，精密称定，分别加入一定量对照品，按“2.2.3”项制备供试品溶液，取续滤液10 μL进样，计算回收率，RSD为1.62%。见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.2.9 样品含量测定 分别取本品内容物约1 g，精密称定，按“2.2.3”项制备供试品溶液，取续滤液10 μL进样，按“2.2.1”项色谱条件测定，见表2。

表 2 样品含量测定结果（n=9） mg/g

3 讨论

在甘草查尔酮A薄层鉴别实验中，常见的文献方法对展开剂的选择较多，有以丙酮-氯仿（4∶6）及环己烷-乙酸乙酯（5∶9）作为展开剂［11］等多种方法，本研究通过反复对比，发现以丙酮-异丙醇-甲苯-水-氨水（20∶6∶6∶3∶1）为展开剂时分离度良好，阴性无干扰。

在样品的处理过程中，分别采用了甲醇回流提取法、甲醇超声提取法、丙酮超声提取法等方法进行提取，发现使用甲醇超声提取法效果好，而且杂质干扰较小。在提取的过程中考察了超声时间和甲醇体积分数对试验结果的影响，发现超声提取30 min效果优于10、20 min［12-13］。

甘草查尔酮A属于黄酮类物质，通过PDA检测器得到其以甲醇为溶剂时的紫外最大吸收波长为310 nm，故选择紫外检测波长为310 nm。

近年，由于国内外对甘草中黄酮类物质尤其是查尔酮类物质的深入研究，使得这类物质的医院制剂及新药产品不断涌现，但在使用过程中发现，有些产品参照药典标准（含量测定为甘草苷和甘草酸铵）或靠重量法、总黄酮测定法进行质量控制，导致使用过程中出现质量差异性问题（研究表明乌拉尔甘草和光果甘草中查尔酮类物质含量很低）［9-10］。

本研究建立了甘草查尔酮胶囊的薄层鉴别方法和甘草查尔酮A含量测定方法，结果表明，该方法简单，准确，重现性良好，灵敏度高，可为该药物质量控制的建立提供依据，也为全面研究及开发甘草查尔酮类药物提供参考。