抑郁模型大鼠不同脑区5-HT1A蛋白表达及加味温胆汤的干预作用*

张 齐，杨 瑞，韦利军，韦海英，高 月，武 丽

广西中医药大学广西中医基础研究重点实验室，广西 南宁 530200

随着现代社会科技的进步，经济的快速发展，高效率快节奏的工作、生活方式，致使人们的心理负荷不断加重，由心理、社会环境等因素导致的精神、心理和心身疾病的发病率日渐增高，在我国疾病流行谱中的地位显著上升，尤其抑郁症已经成为当今社会的多发病、常见病，是全球面临的重大公共卫生问题［1-3］。在最新中国精神疾病流行研究中发现抑郁症已成为精神障碍患病率排名第二位的疾病，终生患病率高达7.4%。抑郁症患者的发病机制与“边缘系统-皮层-纹状体-苍白球-丘脑”神经环路关系密切，神经影像学研究发现额叶、扣带回、海马、基底节等脑区的结构及功能连接改变可导致抑郁症的发生［4-6］。

抑郁症属中医“郁证”范畴，是由情志不舒，气机郁滞引起的一类病证。主要表现为心情抑郁、情绪不宁、胁肋胀痛，或易怒善哭，以及咽中如有异物梗阻、失眠等各种复杂症状［7-8］。情志致郁理论在明代已经形成，而且随着现代社会竞争的加剧，生活压力增大而日益受到重视。现代医学结合社会文化、心理、遗传等各因素，强调了失败的生活事件引起的情志不舒在抑郁症发病中的重要促发作用。升降平调为旨的中药复方温胆汤出自姚僧垣《集验方》，全方寒温平调、升降并用，即可理气解郁，又可降逆化痰，临床实践证实对情志具有双向调节作用，但机制尚未阐明。因此，本课题在前期研究工作的基础上，以抑郁模型大鼠海马、下丘脑、前额皮质、杏仁核不同脑区5-HT1A受体蛋白表达变化为切入点，比较抑郁模型大鼠不同脑区5-HT1A受体蛋白表达差异，探讨加味温胆汤“升降平调”抗抑郁作用的神经生化机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组选用SPF级雄性SD大鼠，体质量180～200 g（购自湖南斯莱克达实验动物有限公司），动物合格证号：SYXK（桂）2019-0001。大鼠造模前进行旷场实验，将行为学评分相近的32只大鼠随机分为抑郁模型组、抑郁中药组、抑郁西药组、正常对照组各8只。

1.2 药物制备百忧解（礼来苏州制药有限公司，国药准字520160029，规格：20 mg/片）。加味温胆汤药物组成：枳实2枚，竹茹6 g，半夏6 g，橘皮9 g，生姜12 g，甘草3 g，石菖蒲9 g，合欢花12 g。经中药植化室鉴定后按照标准操作规程煎煮，煎煮液浓缩成浸膏，4 ℃冰箱内保存备用。

1.3 仪器与试剂蛋白核酸凝胶电泳转印系统（BIO-RAD，Mini Protean Tetra Cell Mini Transblot cell）；电泳仪（BIO-RAD，PowerPac Universal）；凝胶成像分析系统（BIO-RAD，ChemiDoc）；小动物行为记录分析系统（上海软隆，Anymaze）；台式高速冷冻离心机（Thermo Fisher，ST16R）；5×蛋白上样缓冲液（Solarbio，P1040）；ECL超敏发光液（Solarbio，PE0010）；十二烷基磺酸钠（Solarbio，S8010）；30%丙烯酰胺甘氨酸（Solarbio，A1011）；5HT1A Receptor兔多克隆抗体（Abcam，ab85615）；辣根酶标记山羊抗兔lgG（Abcam，ab205718）。

1.4 方法

1.4.1 模型制备与评价

1.4.1.1 慢性轻度不可预见性 应激抑郁动物模型［9］自分组之日起，抑郁模型组及抑郁中、西药组接受21天各种未预知的应激，包括通宵照明，24 h禁食，24 h禁水，45 ℃烘箱热烘5 min，4 ℃冷水游泳5 min，夹尾l min，高速水平振荡3 min，悬尾l min，100伏电击足底l min等9种刺激，21天内随机安排每日给予1种刺激，同一种刺激不能连续出现，每种刺激出现2～3次，使动物不能预知刺激方式。

1.4.1.2 动物模型行为学评价［10］旷场实验（Open-field法）是比较常用而客观的动物模型行为学研究方法。将大鼠置于敞箱底面的中心方格内，以动物穿越底面的格数为水平运动次数，反映动物的活动度；以后肢直立次数（两前爪腾空或攀附箱壁）为垂直运动次数，反映动物对新鲜环境的好奇程度。记录水平运动次数及垂直运动次数，每只大鼠测定1次，每次3 min，用清水和75%酒精依次彻底清洁敞箱后，再进行下一只大鼠的观察。

1.4.2 药物干预方法 造模后开始给药，给药时间为35天，抑郁中药组胃饲加味温胆汤药液12 g/kg；抑郁西药组胃饲百忧解1.8 mg/kg，以上各组药物用0.5%羧甲基纤维素溶液配制，各组均给相同体积的受试药物0.1 mL/10 g，每日1次。抑郁模型组和正常对照组胃饲等容量生理盐水，所有动物自由进食和饮水，每日8：00开始给药，干预过程中抑郁中药组大鼠死亡2只。

1.4.3 取材方法 末次给药结束，行为学检测之后，10%水合氯醛（0.3～0.4 mL/100 g体质量）腹腔麻醉各组大鼠，迅速断头、冰上取脑，冰上分离前额皮质、海马CA3区、下丘脑及杏仁核，剪碎，加入预冷1.5 mL裂解缓冲液，冰上匀浆，冰上孵育30 min，将匀浆液转移至1.5 mL的EP管，4 ℃离心半径16 cm，10000 r/min离心10 min，取上清，再离心10 min，取上清，-20 ℃保存备用。

1.4.4 5-HT1A蛋白Western blot检测方法［11］提取前额皮质、杏仁核、下丘脑及海马CA3区组织中总蛋白，BCA蛋白定量法测定各脑区蛋白浓度，根据蛋白浓度，以40 μg/孔的蛋白量上样电泳，各脑区蛋白经转膜封闭后4 ℃分别与一抗5-HT1A（1∶1500）、β-actin（1∶1500）蛋白摇床过夜；次日分别与辣根酶标记山羊抗兔lgG（1∶2000）结合反应，ECL发光显色后于凝胶成像分析系统中曝光测定条带灰度值，采用Image J软件对图像进行光密度值分析，以β-actin作内参蛋白，分析目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值比值。

1.5 统计学方法采用SPSS 26.0软件分析数据，以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用Kruskal-Wallis H检测，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学抑郁模型大鼠水平运动次数、垂直运动次数及总路程较正常对照组减少（P＜0.05），加味温胆汤能改善抑郁模型大鼠行为表现（P＜0.05），百忧解只对总路程有影响（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠行为学比较（±s）

表1 各组大鼠行为学比较（±s）

注：a表示与正常对照组比较，P＜0.01；b表示与抑郁模型组比较，P＜0.01

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2.2 大鼠不同脑区5-HT1A蛋白表达抑郁模型组大鼠海马CA3区5-HT1A蛋白表达升高，加味温胆汤能降低CA3区5-HT1A蛋白表达（P＜0.05），百忧解能提高杏仁核5-HT1A蛋白表达（P＜0.05）。见表2及图1。

表2 各组大鼠不同脑区5-HT1A蛋白相对表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠不同脑区5-HT1A蛋白相对表达水平比较（±s）

注：a表示与正常对照组比较，P＜0.01；b表示与抑郁模型组比较，P＜0.01

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图1 不同脑区5-H1A蛋白相对表达情况

3 讨论

无论是新型抗抑郁药物还是传统抗抑郁药物，在治疗抑郁症过程中都会出现诸多不良反应。三环类抗抑郁药（tricyclic antidepressant，TCA）为第一代单胺再摄取抑制剂，临床用药包括阿米替林、丙咪嗪以及多虑平，不良反应主要源于抗胆碱作用，可能造成患者便秘、尿潴留及视力模糊等情况，更有甚者会造成患者体位性低血压、心律失常以及心肌梗死等［12-15］。选择性5-HT再摄取制剂副作用小，患者依从性较好，但有一定耐受性，也有常见的不良反应，包括恶心、头痛、腹泻、激越、失眠、嗜睡、眩晕、颤抖、性功能障碍［16-18］。另外，帕罗西汀有体位性低血压，氟西汀可致再生障碍性贫血等副反应［19-25］。中医药因擅长身心整体论治而在疾病的防治中具有一定优势，中药复方以多成分、多环节、多层次、多靶点的药理学作用见长［2，21-26］。因此，从天然药物和中药复方中寻找、研制疗效好、副作用小、适合长期服用的抗抑郁药日益受到重视。

本研究在中医情志理论指导下，在前期工作基础上，认为寒温平调、升降并用的中药复方加味温胆汤可能通过调节情绪神经回路不同脑区的5-HT1A蛋白变化发挥抗抑郁情志调节作用。本研究结果表明，抑郁模型大鼠不同脑区5-HT1A蛋白表达不一致，抑郁模型大鼠主要表现为海马CA3区5-HT1A蛋白表达升高，而加味温胆汤可能通过降低抑郁模型大鼠海马CA3区5-HT1A蛋白表达，从而实现抗抑郁、情志调节作用，但详细机制有待进一步阐明。