基于网络药理学方法探讨黄连抗焦虑的潜在作用机制*

刘思洁，过伟峰，王君君，王小玲

南京中医药大学，江苏 南京 210023

焦虑症分为慢性焦虑和惊恐障碍两种形式，主要表现为强烈、持续、与实际环境不符的担忧和恐惧，常伴有心动过速、失眠等自主神经功能紊乱症状。焦虑的病因、发病机制尚不明确，西医治疗以苯二氮卓艹类、非苯二氮类抗焦虑药、选择性5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)再摄取抑制剂等抗焦虑药为主，但常存在体质量增加、嗜睡、药物依赖等不良反应。中医药治疗焦虑症具有较好疗效，尤以黄连温胆汤最为常用［1-4］。《本草纲目》谓黄连“泻肝火，去心窍恶血，止惊悸”，是治疗心烦、失眠、心悸不宁的常用药物。本研究旨在利用网络药理学方法研究黄连抗焦虑的作用靶点和信号通路，为临床应用提供依据。

1 研究方法

1.1 黄连有效成分及其蛋白靶点从中草药系统药理学平台中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以“黄连”为关键词搜索黄连的活性成分。按口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%、药物相似性（drug-likeness，DL）＞0.18进一步筛选黄连的主要活性成分。运用TCMSP数据库，获得黄连所有蛋白靶点，借助Perl语言获得黄连主要活性成分相对应的蛋白靶点，利用Uniprot数据库、Perl语言将靶点蛋白名转化成基因名。

1.2 药物和疾病交集靶点筛选在GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）和人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）中以“anxiety disorder”为关键词搜索获取疾病相关基因。利用R软件筛选出疾病基因与药物靶基因的共同交集，绘制韦恩图。

1.3 “黄连-活性成分-靶点基因-焦虑”网络和蛋白互作网络构建利用Cytoscape 3.8.0软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，运用String数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl）输入药物靶点基因与疾病基因的交集，定义物种为“Homo sapien”，构建黄连治疗焦虑症的蛋白-蛋白相互作用网络。最低互动评分设定为0.4，显示设置隐藏游离点，其余保持默认值，得到蛋白互作网络。前30名蛋白及节点连接数量用柱状图表示。

1.4 关键靶点的GO（gene ontology）富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析用R软件载入Bioconductor数据包及相关分析所用数据包，以pvaluecutoff=0.05，qvaluecutoff=0.05为标准进行GO富集分析和KEGG通路分析，并将结果可视化。

2 结果

2.1 黄连活性成分及靶蛋白基因筛选结果通过挖掘共得到黄连主要活性成分14种。去除不存在对应基因和重复存在的靶点，最终获取黄连主要活性成分作用靶点84个。见表1。

表1 黄连有效活性成分

2.2 韦恩图利用Genecard疾病数据库和OMIM数据库获得焦虑相关疾病靶点信息，将其与黄连的主要活性成分靶点取交集，再利用R软件绘制韦恩图。蓝色圆圈代表疾病相关靶点5311个，红色圆圈代表黄连主要活性成分靶点84个，2个圆圈相交部分代表黄连和焦虑的67个共同靶点，为黄连抗焦虑的关键靶点。见图1。

图1 黄连有效成分与作用靶点韦恩图

2.3 “黄连-活性成分-靶点基因-焦虑”网络图利用Cytoscape 3.8.0构建“黄连-活性成分-靶点基因-焦虑”网络，其中红色圆圈代表药物黄连，蓝色圆圈代表疾病焦虑症，绿色方块为黄连治疗焦虑症的有效活性成分12个节点，黄色方块代表相关靶点基因67个节点，见图2。由图可知，黄连抗焦虑具有多成分、多靶点的特点，可以看出核受体辅活化子2（NCOA2）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1)、PRSS1、前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1）基因靶点与黄连活性成分联系最密切。

图2 黄连-活性成分-靶点基因-焦虑网络图

2.4 关键靶点蛋白互作网络将交集靶点导入STRING数据库，为了网络简洁有效，关联评分设定为0.4，显示隐藏游离蛋白靶点，其余保持默认值，获得关键靶点蛋白互作网络，共64个节点，374条连线，节点表示靶点，边表示各作用靶点间的关联，两靶点间的连线越多，表示两者关系越密切。节点发出的边越多表示其越可能成为核心靶点。用柱状图表示其中关联度最高的前30个靶点。见图3—4。

图3 PPI网络图

图4 关键靶点蛋白关联度排名前30位节点度值柱状图

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析GO和KEGG富集分析从基因功能和通路两个方面解读差异基因的生物学功能，GO富集分析涵盖细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物过程（biological process）3部分。以p=0.05，q=0.05为筛选条件，得到相关条目共840条，生物过程721条，细胞组分36条、分子功能83条，取3部分中富集程度前10位基因功能绘制成图。KEGG通路富集分析以p=0.05，q=0.05为筛选条件，得到相关条目78条，取富集程度前20位信号通路绘制成图。见图5—9。

图5 GO功能富集分析柱状图

图6 GO功能富集分析气泡图

图7 KEGG功能富集分析柱状图

图8 KEGG功能富集分析气泡图

图9 AGE-RAGE信号通路

3 讨论

焦虑症属中医学“郁证”“惊悸”“不寐”“百合病”等范畴。病因以情志刺激为主，病位在心，与肝胆脾肾相关。肝气郁结，肝郁化火，灼液成痰，痰热互结，上扰心神而致焦虑烦躁。《医宗金鉴》中说：“心静则藏神，若七情所伤，则心不得静，而神躁不宁也。”符为民［1］认为痰热内扰是焦虑症最常见的病机，以黄连温胆汤治疗焦虑症效果显著，其中黄连作为君药起清心除烦之效。交泰丸由黄连、肉桂组成，交泰丸联合乌灵胶囊可降低失眠伴焦虑患者的焦虑自评量表（self-rating anxiety scale，SAS)评分［5］，效果优于艾司唑仑。黄连阿胶汤出自《伤寒论》，方用黄连泻心火，使心气下交于肾，其减轻焦虑的效果较西药更明显，且不良反应小［6］。

黄连的主要成分有生物碱类、黄酮醇类、微量元素等［7］。生物碱类中的黄连碱［7-8］、黄酮醇类中的槲皮素［9］已被证明可通过调节脑内神经递质起抗焦虑作用。此外，本研究显示黄连的其他有效成分如小檗碱、巴马汀、黄连苷、小檗浸碱等靶点与焦虑的靶点对接数目较多，也具有抗焦虑作用。

从PPI网络图可知，黄连抗焦虑的作用机制多样，黄连作用靶点和焦虑症靶点之间相互影响、关系复杂，主要有以下几类：1）炎症相关蛋白：白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、原癌基因（Fos proto-oncogene，FOS）、芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor，AHR）、C反应蛋白（C reactive protein，CRP）；2）性激素相关蛋白：雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、AR、雌激素受体2（estrogen receptor 2，ESR2）；3）胰岛素相关蛋白：过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA）、胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)；4）脂类代谢相关蛋白：PPARA、窖蛋白-1（caveolin-1，CAV1）。可以推测黄连抗焦虑可能与调控炎性反应、调节性激素水平、调节胰岛素水平、脂类代谢等相关。现代研究提示焦虑与免疫系统［10］、内分泌系统［11］相互影响，表现为T细胞紊乱及下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的紊乱，这与本研究结果一致。

GO富集分析显示，黄连抗焦虑的生物过程主要涉及对外源性刺激的反应、类固醇激素反应、氧化应激反应等；分子功能主要涉及核受体活性、配体激活转录因子活性、类固醇激素受体、G蛋白偶联胺受体活性等；细胞组成包括突触当中各部分、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、胆碱能突触等。KEGG富集分析结果表示，黄连抗焦虑与糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路等78条通路有关。核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是与炎症相关的经典信号通路，NF-κB的激活诱发IL-6、白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等大量促炎细胞因子的表达和释放，引起焦虑［12］。AGE-RAGE信号通路中，糖基化终末产物AGEs升高引起晚期糖基化终产物异常高表达并与晚期糖基化终产物结合后激活p38大鼠肉瘤（rat sarcoma，ras）蛋白及丝裂原化蛋白激酶途径，上调并激活NF-κB表达［13］。卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路也包含NF-κB。TNF信号通路中TNF除了激活NF-κB外还通过调节5-HT及其转运蛋白、调控氧化应激反应导致焦虑［14］。以此推断，阻断NF-κB通路可能成为研究黄连治疗焦虑症的新切入点。

综上所述，黄连可通过多分子、多靶点、多途径治疗焦虑症，其物质基础可能为小檗碱、槲皮素，其机制可能是调节脑内神经递质、调控炎性因子表达、减轻氧化应激反应、调节内分泌及免疫紊乱等。本研究基于网络药理学获得黄连抗焦虑的多个靶点及通路，同时本研究发现黄连抗焦虑的某些作用靶点如CASP、MYC及信号通路如卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染的相关文献较少，本研究结果可为以后扩展黄连抗焦虑研究提供思路。