半夏厚朴汤治疗咳嗽变异性哮喘的网络药理学研究

李 琦，唐以军，王梅芳

湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北 十堰 442000

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是以咳嗽为唯一或主要症状的哮喘亚型，是慢性咳嗽的主要病因。中国CVA患者在慢性咳嗽患病人数中占32.6%，高于西方国家和日本［1］。由于CVA没有典型的临床症状，在临床诊断中容易被误认为呼吸道感染、支气管炎、慢性咽炎等疾病，导致滥用抗生素、镇咳药物治疗。CVA治疗与哮喘类似，主要以糖皮质激素、β2受体激动剂为主，起效快，但不良反应较大。传统中药注重整体治疗，具有应用安全、有效、不良反应小等优势。

半夏厚朴汤源自东汉张仲景《伤寒杂病论》，经晋代王叔和重编后载于《金匮要略·妇人杂病脉证并治第二十二》。该方由半夏、厚朴、茯苓、生姜、苏叶组成，全方辛苦合用行气散结，降逆化痰。临床用于治疗各种情志不畅，痰气互结所致的疾病，CVA为其中之一［2］。黄丽娜［3］、陈豪等［4］研究显示半夏厚朴汤联合特布他林治疗CVA较单用特布他林能更快缓解患者咳嗽等呼吸道症状，降低血清嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）、白细胞介素13水平，减轻气道高反应性，改善呼吸道炎症情况。江丽平［5］、程娜娜等［6］研究显示半夏厚朴汤联合西药治疗CVA较单用西药效果更优，总有效率更高。盛梅［7］研究显示半夏厚朴汤不仅能有效改善临床疗效，还能降低并发症发生率，有临床应用价值。由于CVA的病理机制复杂，且中药成分复杂，作用靶点广泛，因此半夏厚朴汤治疗CVA的靶点及分子机制尚不清楚。本研究借助网络药理学方法对半夏厚朴汤治疗CVA的作用机制进行研究，为其进一步药理作用研究及临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 半夏厚朴汤活性成分及靶点筛选以半夏、厚朴、茯苓、生姜、苏叶为关键词，通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，类 药 性（drug-likeness，DL）＞0.18为条件，筛选出半夏厚朴汤的活性成分，通过TCSMP数据库在线查询筛选出的有效活性成分所对应的相关靶点。然后使用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），物种限定为人，校正有效活性成分对应的靶点，得到活性成分对应的靶点基因名。

1.2 CVA靶点预测GeneCards数据库是包含人类RNA基因、蛋白质编码基因、转录基因等基因组的综合数据库。登录GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库，检索“cough variant asthma”，得到咳嗽变异性哮喘相关基因。将疾病靶基因与药物靶基因输入在线韦恩图（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），获得疾病与药物的共同靶点即半夏厚朴汤治疗咳嗽变异性哮喘的潜在作用靶点。

1.3 半夏厚朴汤-活性成分-CVA靶点网络图将半夏、厚朴、茯苓、生姜、苏叶的主要活性成分及其对应的靶点与半夏厚朴汤治疗CVA的潜在作用靶点进行映射，然后将其导入Cytoscape 3.7.1软件，得到半夏厚朴汤-活性成分-CVA靶点网络。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建将半夏厚朴汤治疗CVA的潜在作用靶点输入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）在线数据库，种属限定为“Homo sapiens”，最小连接评分（Combined score）为0.4，导出相应结果文件。将所得文件导入Cytoscape 3.7.1软件，利用软件中的“Network Analyzer”工具，得到Degree值（连接度），根据Degree值调整节点的大小和颜色，获得最终的蛋白相互作用网络图。

1.5 基因富集分析DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）是一个整合了生物学数据和分析，为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息的生物信息数据库。将靶点基因输入DAVID 6.8数据库，限定物种为人，P＜0.05，对靶基因进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1 半夏厚朴汤活性成分共筛选出半夏厚朴汤活性成分44个，包括半夏13个、厚朴2个、茯苓15个、生姜5个、苏叶14个，其中半夏、苏叶、生姜有1个交集化合物，半夏、苏叶有1个交集化合物，半夏、生姜有1个交集化合物，苏叶、生姜有1个交集化合物。见表1。

表1 半夏厚朴汤活性成分基本信息

续表1

2.2 预测CVA靶点结果共得到CVA相关靶点基因2083个。利用在线工具Venny 2.1.0将CVA相关靶点基因与半夏厚朴汤靶点基因取交集，得到97个疾病-药物共同靶点基因。

2.3 半夏厚朴汤-活性成分-CVA靶点网络通过Cytoscape 3.7.1对97个疾病-药物共同靶点基因与半夏厚朴汤的活性成分进行映射，得到半夏厚朴汤-活性成分-CVA靶点网络图。网络图中共有133个节点，533条边。根据网络拓扑学原理计算后按度值排序，排前5名的活性成分分别是β-谷甾醇（beta-sitosterol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（Stigmasterol）、β-胡萝卜素（beta-carotene）、黄芩素（baicalein）。见图1。

图1 半夏厚朴汤-活性成分-CVA靶点网络图

2.4 蛋白相互作用网络的构建与分析将疾病-药物97个共同靶点基因导入String，获取其相互作用关系，并导入Cytoscape中获得相互作用关系网络，该网络包括97个节点，1282条边。图中degree值越大节点越大，颜色越红。Degree值大于50的节点共13个，按Degree值排序依次为血清白蛋白（albumin，ALB）、丝/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threoninekinase1，Akt1）、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、原癌基因（Fos protooncogene，FOS）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、原癌基因c（Jun protooncogene，JUN）、胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinases1，MAPK1）、禽髓细胞瘤病毒癌基因同源物（V-Myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC）、前列腺素内过氧化物合酶2（Prostaglandin-Endoperoxide Synthases 2，PTGS2）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP9）。见图2。

图2 半夏厚朴汤治疗CVA的PPI网络图

2.5 富集分析结果97个靶点经GO富集分析共得到GO条目141个（P＜0.05），其中生物过程（biological process，BP）108个、分子功能（molecular function，MF）25个、细胞组成（cellular component，CC）8个。根据P值排序，通过每个模块前5个条目（表2）。发现半夏厚朴汤可通过腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、外源性凋亡信号通路等生物学过程，蛋白质同源二聚体激活、蛋白质异源二聚体激活、肾上腺素结合、血红素结合、α1肾上腺素能受体激活等分子功能，细胞核、原生质膜、线粒体外膜、细胞外间隙等细胞组分治疗CVA。KEGG通路富集分析得到97个P＜0.05的信号通路，主要在癌症相关信号通路、HIF-1信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路等通路富集，前20条通路见图3。

表2 半夏厚朴汤治疗CVA的GO分析结果

图3 半夏厚朴汤治疗CVA的KEGG代谢通路富集情况

3 讨论

CVA与支气管哮喘发病机制相似，主要是由多种炎症细胞及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，其主要特征是气道高反应性和气道重塑［8］。本研究应用网络药理学方法探究半夏厚朴汤治疗CVA的作用机制，共收集半夏厚朴汤44个活性成分，排名前5的活性成分分别是β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、β-胡萝卜素、黄芩素，且它们的degree值均大于40，可能是半夏厚朴汤治疗CVA的关键有效成分。β-谷甾醇是最常见的植物甾醇，膳食植物甾醇中β-谷甾醇占50%～65%，其结构与胆固醇类似，已被证明具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和平喘作用［9］。β-胡谷甾醇能减轻哮喘动物模型中EOS浸润，降低白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白细胞介素5（interleukin-5，IL-5）、TNF、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等炎性因子和血清及肺泡灌洗液中免疫球蛋白E(immuno globulin E，IgE)水平，对气道慢性炎症具有保护作用。同时β-谷甾醇通过抑制细胞反应和Th2型细胞因子的释放/合成发挥平喘作用［10-11］。

木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，存在于许多植物中，具有抗氧化、伤口愈合、抗糖尿病、抗炎、抗癌和抗菌等多种作用［12］。2003年DAS等［13］研究发现木犀草素可以降低卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IL-5水平，增加干扰素γ（interferonγ，IFN-γ）水平，降低血清IgE水平，调节气管支气管收缩和支气管高反应性，减轻实验小鼠的哮喘症状。随后国内外多项研究显示木犀草素在治疗哮喘中发挥重要作用。其可以通过抑制TLR4/NF-kB信号活化、抑制COX-2信号通路、调节Th1/Th2平衡等多种途径减少炎性细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α等的合成和分泌，缓解肺部炎症反应，通过降低血清特异性IgE水平降低哮喘气道高反应性［14-16］。

豆甾醇是植物甾醇的典型代表之一，研究发现其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、降胆固醇等作用［17］。ANTWI等［18］研究发现在OVA诱导的哮喘小鼠模型中，豆甾醇可减少嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞增殖，同时减少细支气管周围、血管周围和肺泡周围炎性细胞浸润，抑制血清血管细胞黏附分子1（VCAM-1）和IgE的过度表达；组织病理学显示豆甾醇可逆转胶原沉积，抑制气道重塑。可见，豆甾醇具有显著的平喘作用，并对过敏原诱导哮喘的关键特征有抑制作用。

β-胡萝卜素是维生素A的前体，能与含氧自由基作用发挥抗氧化、清除自由基作用。β-胡萝卜素是人类膳食中维生素A的主要来源，主要在肠道内被吸收，在肠黏膜中转化为活性维生素A，被吸收入血，再通过血液运输到全身其他靶器官，发挥作用。大量研究表明［19］维生素A缺乏与哮喘密切相关。ALLEN S等［20］进行的荟萃分析显示哮喘患者的膳食维生素A摄入量低于非哮喘患者，重症哮喘患者低于轻症患者。TIAN等［21］的研究显示新生儿肺炎链球菌感染后补充维生素A可以通过改变CD4+T细胞亚群抑制哮喘发展。李爱斌等［22］的研究显示β-胡萝卜素联合布地奈德吸入剂治疗哮喘，疗效确切，β-胡萝卜素抗氧化功能可增强机体免疫力，起到抗炎、协调免疫因子、改善呼吸功能的作用，从而提高治疗效果。

黄芩素是从黄芩根部分离出来的一种天然黄酮类物质，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗血栓、抗肿瘤等作用［23］。研究发现黄芩素能降低OVA诱导的小鼠肺组织内炎症细胞数量，降低IL-1β、IL-4、IL-5水平及OVA特异性IgE、IgG1产生，能上调IFN-α水平，降低OVA诱导的气道高反应性（airway hyperreactivity，AHR）、气道炎症及气道周围胶原沉积，减轻哮喘症状［23-24］。通过分析药物治疗CVA的97个关键靶点，提示半夏厚朴汤治疗CVA具有途径多样、靶点广泛、功能丰富的特点。PPI网络图提示半夏厚朴汤治疗CVA机制复杂，主要的靶蛋白有ALB、Akt1、IL-6、FOS、EGFR、VEGFA等。富集分析结果显示，去除广泛信号通路，半夏厚朴汤主要通过HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等发挥作用。HIF-1信号通路在机体氧供需失衡的条件下被激活，介导相关基因表达，调节细胞内氧浓度。HIF-1由α亚基和β亚基共同组成，可以通过多途径参与哮喘气道炎症机制［25］。血管VEGF是HIF-1α下游的主要靶点，KIM等［26］的研究显示在OVA诱导的小鼠和小鼠上皮细胞中抑制HIF-11α可以通过调节VEGF介导的血管生成和血管通透性改变减轻抗原诱导的气道炎症和高反应性。PI3K-Akt信号通路参与调节细胞的应激、增殖、分化、凋亡等过程，是人体重要的信号转导通路。大量研究表明，PI3K/Akt信号通路可通过调节气道高反应性、炎症反应和血管通透性参与哮喘的发生发展［27-28］。有研究表明，阻断PI3K/Akt信号通路可以调节上皮-间质转化的异常过程，减轻哮喘早期气道重构［29］。李鑫等［30］研究表明在小鼠模型中IL-27可通过抑制PI3K-Akt信号通路抑制气道炎症和气道重塑。TNF是通过与细胞膜上特异性受体结合，激活JUN、核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及凋亡等信号通路发挥多种生物效应的细胞因子［31-32］。大量研究显示TNF-α对哮喘的病理生理过程起重要作用。SONG等［33］研究表明大黄酚可抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路激活，可以减轻OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症和气道重塑。XU等［23］研究表明，黄芩素可通过抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路激活，减轻哮喘气道慢性炎症。

综上所述，半夏厚朴汤可能通过多成分、多靶点、多通路对CVA发挥治疗作用，但仍需结合体内外实验验证其可靠性。