新疆8种蔷薇果中可溶性糖组分含量的特征分析

王宁，周钢，张珊滋，王春燕，田莉，3*

（1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区药品检验研究院，新疆 乌鲁木齐 830011；3.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011）

全世界有200多种蔷薇，其中有多种蔷薇的果实可供药食两用，其富含氨基酸、总多酚、总有机酸和糖类等成分[1-2]，具有抗氧化、免疫调节、降血脂、抗癌和抗菌等方面的药理活性[3]；在阿拉斯加、匈牙利和土耳其等地，一些口感独特、营养丰富的蔷薇果也被制成果酱，深受儿童喜爱[4]。新疆地处亚欧腹地，独特的气候和地理条件为蔷薇提供了适宜的生长环境[5]，新疆蔷薇果果型大、肉厚、味甘甜、营养丰富，在食品、药品开发方面具有巨大潜力[1-2]。植物多糖是植物体内具有多种生物学功能的生物大分子，主要由葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖以一定的比例聚合而成，相对分子质量从几万到几百万不等。现代药理研究表明，植物多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗氧化、抗辐射等多种药理作用[6-7]，目前，关于新疆蔷薇果中总多糖和单糖的研究鲜见报道。

多糖主要采用滴定法和紫外分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry，UV-Vis）[8-9]等方法检测。滴定法操作简单、成本低，但试验条件要求较高且滴定终点不易判别；UV-Vis法操作简单、准确、重复性好，目前被广泛应用。单糖目前最常用的检测方法是高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]，糖类物质经衍生化后可连接在紫外可见吸收检测器中（ultraviolet-visible detector，UVD）进行测定，但衍生化操作步骤繁琐且准确性较低；蒸发光检测器（evaporativelight scattering detector，ELSD）[11]可直接检测糖类物质，但灵敏度、重复性和精密度较差；示差折光检测器（differential refractive index detector，RID）[12]检测糖类物质具有灵敏度高、稳定性和重复性好的优点。因此本试验采用UV-Vis和HPLC-RID测定新疆8种蔷薇果中的总多糖和4种单糖的含量，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA）进行综合评价[13]，为后续研发品种的筛选及质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8种不同品种的完全成熟的新疆蔷薇果（表皮为深红色、萼片干枯）于2020年9月采自新疆乌鲁木齐市雅玛里克山和阿勒泰地区海拔的山地或灌丛，经新疆医科大学徐海燕教授鉴定为蔷薇科蔷薇的果实，编号为 S1～S8，见表 1。

表1 样品编号及采集地点Table 1 Sample number and collection location

葡萄糖（纯度大于99.8%）、果糖（纯度大于99.9%）、蔗糖（纯度大于98.8%）：中国食品药品检定研究院；麦芽糖（纯度大于94.4%）：广州硕谱生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Honeywell公司；苯酚、硫酸（分析纯）：天津北联精细化学品开发有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A岛津液相色谱仪、RID-10A检测器：日本岛津公司；722S可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；SL-200高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金厂；XS105电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ-5200DE数控超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；TDL-5A离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；Milli-Q纯水机：美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 总多糖含量的测定

1.3.1.1 供试品提取方法筛选

精密称量S3号干燥样品粉末（80目）2.000 0 g，平行9份，平均分3组，均加入500 mL蒸馏水，分别采用浸渍24 h、超声45 min、煎煮45 min三种方法提取总多糖，采用UV-Vis法测定总多糖含量。

1.3.1.2 供试品溶液的制备

分别精密称取8种新疆蔷薇果粉末（80目）2.0000g，按照1.3.1.1所得最佳方法进行提取，抽滤，滤液作为供试品溶液，备用。

1.3.1.3 总多糖显色条件考察

以蔷薇果中的总多糖作为考察指标，单因素考察5%苯酚用量 0.6、0.8、1.0、1.2 mL，其它条件为浓硫酸3 mL、50 ℃ 加热 20 min；浓硫酸用量 3、5、7 mL，其它条件为5%苯酚用量1.0 mL、50℃加热20 min；加热温度 40、50、60、80℃，其它条件为 5%苯酚用量 1.0 mL、浓硫酸 5 mL、加热 20 min；加热时间 10、20、30、40 min，其它条件为5%苯酚用量1.0 mL、浓硫酸5 mL、加热温度50℃。

1.3.1.4 总多糖线性关系考察

精密称取葡萄糖对照品适量，制备浓度为5.138μg/mL的葡萄糖对照品溶液。精密移取 0、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80、3.20、3.60 mL，加入 2 mL 蒸馏水，按照最佳显色条件在490 nm处测定吸光度[14]。以葡萄糖的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.1.5 精密度、重复性和稳定性考察

将方法“1.3.1.4”的葡萄糖对照品溶液的吸光度重复测定6次，记录并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，考察仪器精密度。

取S3样品粉末按照“1.3.1.2”方法，平行制备6份供试品溶液，按“1.3.1.3”方法，测定吸光度，计算RSD值，考察重复性。

取方法“1.3.1.4”中对照品溶液，25℃放置，在0、2、4、8、12、24 h 分别测定吸光度，计算 RSD 值，考察样品的稳定性。

1.3.1.6 加样回收率试验

精密称量已知总多糖含量的S3样品粉末2.0000g，平行9份，按照样品含量的80%、100%和120%加入葡萄糖对照品，每组平行3份，按照“1.3.1.2”方法制备供试品溶液，根据方法“1.3.1.4”中的条件测定，计算回收率，考察该方法的准确度。

1.3.1.7 新疆蔷薇果样品中总多糖含量测定

精密移取“1.3.1.2”方法中的供试品液各0.1 mL，按照方法“1.3.1.4”的条件测定样品中总多糖含量。

1.3.2 新疆蔷薇果单糖组分分析

1.3.2.1 对照品储备液制备

精密称取适量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖对照品，分别置于10 mL容量瓶，用40%乙腈溶解配制质量浓度分别为 50.28、40.12、20.45、20.98 mg/mL 的对照品储备液。

1.3.2.2 供试品溶液制备

取方法“1.3.1.2”中的供试品溶液125 mL，水浴蒸干，用5 mL 40%乙腈复溶，0.45 μm滤膜过滤，滤液为单糖组分供试品溶液。

1.3.2.3 色谱条件

色谱柱CAPCELLPKANH2（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-水，在此基础上考察流动相的比例；流速：1.0 mL/min，柱温：40℃，检测池温度 40℃，进样15 μL。

1.3.2.4 线性关系考察

分别精密量取“1.3.2.1”方法中的单一对照品储备液，梯度稀释制备系列浓度各单一对照品溶液，按方法“1.3.2.3”的条件进行测定，记录峰面积。以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2.5 精密度、重复性和稳定性考察

取“1.3.2.4”方法中的对照品溶液，按“1.3.2.3”色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD值，考察仪器的精密度。

取S3样品粉末按照方法“1.3.2.2”制备供试品溶液，平行6份，然后按“1.3.2.3”方法测定，记录峰面积，计算RSD值，考察重复性。

取方法“1.3.2.4”中的对照品溶液，25℃放置 0、4、8、12、24、48 h，再按照方法“1.3.2.3”条件进行测定，记录峰面积，计算RSD值，考察4种单糖的稳定性。

1.3.2.6 加样回收率

精密称量已知含量的S3样品粉末2.000 0 g，平行6份，按已知含量100%加入果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖对照品，按照方法“1.3.2.2”制备供试品溶液，再按方法“1.3.2.3”的条件测定，记录峰面积，计算各成分的加样回收率，考察该方法的准确度。

1.3.2.7 蔷薇果中单糖组分的含量测定

将方法“1.3.2.2”中的样品溶液按照方法“1.3.2.3”进行测定，计算各样品中单糖组分的含量。

1.3.3 数据处理与分析

以蔷薇果中总多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量为变量，利用Origin 2018软件对样品中的5种成分进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及聚类分析（cluster analysis，CA）。

2 结果与分析

2.1 总多糖提取方法的确定

总多糖含量结果：煎煮法总多糖含量为263.48mg/g、超声法总多糖含量为187.52 mg/g、浸渍法总多糖含量为126.79 mg/g。因此，确定煎煮法为供试品提取方法。

2.2 总多糖测定方法的确定

表2为总多糖测定方法的单因素考察结果。

表2 单因素考察结果（n=3）Table 2 Results of the single factor examination（n=3）

由表2可知，以1.0 mL 5%苯酚溶液，5 mL浓硫酸，50℃加热30min为显色条件，放至25℃后进行测定，此时S3样品最为稳定且总多糖含量最高，为263.48mg/g，因此，以此条件为最佳。

2.3 总多糖含量测定方法学考察

葡萄糖的线性方程为A=26.152C+0.013 4（r=0.999 2），表明葡萄糖含量在 7.65 μg/mL～22.67 μg/mL范围线性关系良好。精密度考察的RSD值为0.96%。表明该仪器精密度良好。重复性考察的RSD值为0.67%，表明该方法重复性良好。稳定性考察的RSD值为0.91%，表明总多糖在24 h内稳定。对样品进行加样回收率测定试验，结果见表3。

表3 加样回收率结果（n=9）Table 3 Results of sample adding recovery（n=9）

如表3所示，平均加样回收率为99.87%，RSD值为1.20%，表明本法测定总多糖含量准确。

2.4 单糖组分含量测定方法学考察

2.4.1 专属性与线性考察

依据《中国药典》[15]，考察流动相的比例对蔷薇果中4种单糖成分色谱行为的影响，HPLC-RID色谱分析图如图1所示。

图1 对照品和样品溶液的HPLC-RID色谱分析图Fig.1 HPLC-RID chromatograms of standard and sample solution

由图1A可知，当乙腈与水体积比为80∶20时，4种单糖成分的出峰时间在15 min以内，果糖和葡萄糖的分离度小于1.5；由图1B可知，当乙腈与水的体积比为70∶30时，待测物质对称因子为1.45且麦芽糖无检测峰；乙腈与水的体积比为75∶25时，4种单糖成分的分离度大于1.5，对称因子为1.02，理论塔板为3 320，适用于4中单糖类成分检测。

2.4.2 线性考察

4种单糖成分的线性考察结果见表4。

表4 4种单糖回归方程、线性范围及相关系数Table 4 Regression equations，linear ranges and correlation coefficients of four monosaccharides

如表4所示，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖分别在质量浓度 5.01 mg/mL～35.09 mg/mL、4.04 mg/mL～28.28 mg/mL、0.25 mg/mL～8.06 mg/mL、0.24 mg/mL～7.73 mg/mL的范围内线性关系良好，相关系数r≥0.999 6。

2.4.3 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验

果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的精密度考察RSD分别为0.27%、0.25%、0.69%、0.94%，表明仪器精密度良好；重复性考察的RSD分别为2.17%、2.38%、1.95%、2.72%，表明方法的重复性良好；稳定性考察的RSD分别为2.36%、1.51%、2.41%、2.55%，表明4种单糖在48 h内稳定；4种单糖成分的加样回收率试验结果见表5。

表5 4种单糖成分的加样回收率试验结果（n=6）Table 5 Results of the spiked recovery test for the 4 monosaccharides（n=6）

续表5 4种单糖成分的加样回收率试验结果（n=6）Continue table 5 Results of the spiked recovery test for the 4 monosaccharides（n=6）

由表5可知，平均加样回收率分别为99.51%、99.24%、100.46%和 102.32%，RSD值分别为1.25%、0.66%、1.21%和2.43%，表明本法测定4种单糖含量准确。

2.5 含量测定

新疆8种蔷薇果中总多糖含量及4种单糖组分含量结果见表6。

表6 新疆8种蔷薇果样品中总多糖和4种单糖组分的含量Table 6 Content of total polysaccharides and four sugars in 8 Xinjiang Rosa fruits samples

表6结果显示，总多糖和4种单糖组分的含量差异较大，含量分布范围较广。其中S4号样品总多糖含量最高，S3号样品果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量最高。

2.6 主成分分析

主成分分析（PCA）运用降维的思维，通过提取对应特征值大于1的成分，排除重叠信息，减少变量，并对数据进行相似性分类[16-17]。本文以新疆8种蔷薇果中总多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖5种成分为变量进行PCA分析，结果如表7所示。

表7 主成分分析方差贡献率Table 7 Principal component analysis variance contribution rate

表7结果表明，提取获得的主成分为总多糖和果糖，累计的方差贡献率为87.85%，前2个主成分因子的特征值分别为3.38和1.02，表明这2个主成分可以代表8种药材中5个成分87.85%的信息。

旋转后的因子载荷矩阵可以表示主成分与其对应变量的相关系数[18-19]，结果见表8。

表8 旋转后的因子载荷矩阵Table 8 Rotated component matrixa

采用得到的2个主成分对8种不同蔷薇果进行评分，计算2个主成分的单独得分，表达式如下。

Y1=-0.070X1+0.159X2+0.177X3+0.172X4+0.084X5

Y2=0.903X1+0.033X2-0.139X3-0.134X4+0.281X5

以2个主成分所对应的方差贡献率为权重，获得综合评价函数为Y=67.511%Y1+20.334%Y2，计算样品的综合得分并进行排序，结果见表9，样品S3质量最好。

表9 8种蔷薇果样品的主成分因子得分、综合得分和排序Table 9 Factor scores，comprehensive scores and sorting of principal components of 8 Rosa of fruits kinds of samples

2.7 聚类分析

聚类分析（CA）是一个“物以类聚”的分类过程，通过计算样品间的欧氏距离，根据样品间的相似性进行分组[20]。本研究以新疆8种蔷薇果中5种成分的含量为变量，以样品间的欧式距离为区间分析样品之间的异同[21]。聚类分析树状图如图2所示。

图2 蔷薇果的聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram for clustering analysis of the Rosa of fruits

由图2可知，在树状图的距离75处为标准进行归类，可将样品分成 3 类，S5、S7 和 S8 归为一类，S1、S2、S4、S6归为一类，S3归为一类。此分析结果与主成分分析结果一致。

3 结论

本试验采用UV-Vis和HPLC-RID分析测定新疆地区8种蔷薇果中总多糖和4种单糖成分的含量，考察不同提取方法以及总多糖和4种单糖组分测定方法的提取效率，所建立的方法经过严格的方法学考察，操作简单、精密度好、灵敏度高，适用于果实类中糖的检测。8种蔷薇果中波斯单叶蔷薇（S3）的综合评分最高，其次为宽刺蔷薇（S2）、密刺蔷薇（S5）和疏花蔷薇（S6），研究结果可为新疆蔷薇果的开发及综合利用提供试验依据。