3种草本凋落物混用强化修复石油污染土壤的效果

2023-02-02周雯星王丽洁黄琰莹张晓曦

石油学报（石油加工） 2023年1期

周雯星，胡漫，王丽洁，田爽，陈风，黄琰莹，张晓曦,2

(1.延安大学生命科学学院，陕西延安 716000；2.陕西省黄土高原资源植物研究与利用省市共建重点实验室，陕西延安 716000)

作为最主要的能源和工业原料之一，石油为推动世界经济发展提供了重要动力。然而其开发过程中频发的泄漏事故或废物不当处理已造成了不同程度的土壤污染，使土壤透气导水通路减少、抑制生物的生长甚至造成其死亡或群落结构改变，导致土壤生态功能被破坏、生态系统退化等问题[1-2]，尤其在油田开采区这类环境问题亟待解决。

生物刺激是目前广受关注的油污土壤修复技术之一，具体是指通过添加刺激剂、改善土壤养分限制状态和微生境、提高土著菌对污染物的降解能力的1种技术。植物残体(如凋落物)作为生物刺激剂的1种，易于获得且成本低廉。进入土壤后，其可显著改善土壤水、气条件[3]，同时释放养分和简单有机物(如糖类和氨基酸)为降解菌提供易利用碳源和氮、磷源，解除其生长受到的限制；或释放有机酸、黄酮、萜类、多酚和木质素等辅助降解菌，吸收并分解污染物或诱导相应的降解酶(如木质素过氧化物酶、漆酶、锰过氧化物酶和脱氢酶等)的分泌，从而大幅提高石油降解率[4-5]。如添加麦草秸秆后，油污土壤中厚壁菌门(Firmicutes)细菌等降解微生物的丰度显著提高，使C14～C30烷烃降解90%以上[4]；可可豆荚和大蕉皮等农业废弃物可有效促进土壤中石油降解细菌和真菌的增殖，使石油降解率达到80%以上[6]；而紫花苜蓿(Medicagosativa)凋落物处理120 d后，使石油残留量比自然衰减对照减少60%以上[7]。

然而，现有研究多数仅仅关注单种植物残体的修复效果，而较少关注混合植物残体的修复能力。有研究表明，使用单种植物残体处理污染土壤时，可能由于某些残体化学组成的特殊性(如富含氮素但磷素缺乏)导致其对降解菌生长的促进作用受限，抑或因分解缓慢而无法在污染物老化前充分发挥促进降解的作用。而数种植物残体混合分解时往往可为微生物提供更均衡的养分、加速凋落物整体的分解和物质释放。相应地，其对土壤生化性质的影响也呈现类似的非加和效应[8-9]。当混合分解产生明显协同作用时，即可能显著改善土壤的生化性质。例如，马尾松(Pinusmassoniana)、小叶栎(Quercuschenii)和白茅(Imperatacylindrica)凋落物混合处理后，土壤全氮和速效钾含量显著增加，对微生物数量和多样性的改善效果也显著高于任一单种凋落物的处理效果[8]；小叶杨(Populussimonii)与落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)凋落物混合分解时，其对土壤过氧化氢酶和脱氢酶等活性的提高率均表现一定的协同效应[9]。鉴于上述土壤性质均显著影响石油污染物的降解，笔者推测采用混合植物残体处理油污土壤，可能可以利用其对土壤相关生化性质的协同改善强化其修复效果。然而，已有研究对于混合残体修复效果的关注仍较少，且往往将混合视为一个整体而不考虑凋落物间的相互作用，因此上述推测尚需进行实验验证。

陕北地区是中国主要的石油基地之一，同时其脆弱生境也受到石油污染的严重威胁。达乌里胡枝子(Lespedezadavurica)、铁杆蒿(Artemisiagmelinii)和黄蒿(Artemisiascoparia)是当地常见的野生植物，且在污染区能够大量生长，其凋落物是污染区周边最易获取的植物残体。因此，笔者以上述3种植物的单种和混合凋落物处理含石油质量分数15 g/kg的油污土壤，比较单种和混合凋落物处理对去除石油污染物的效果。另外，考虑到对油污土壤修复最终需要实现对土壤功能的恢复[10]，同时评价了混用凋落物对改善土壤受损生化性质的效果是否也存在强化效应。以期为探索通过简单混合方式强化植物残体修复效果的技术途径提供科学依据。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

石油购自延安市延长县严家湾镇某采油区。达乌里胡枝子凋落物(LD)、铁杆蒿凋落物(AG)和黄蒿凋落物(AS)，于2018年10月采集自延安市延长县严家湾镇某采油区附近未污染区域，通过齐地刈割的方法收集3种凋落物后，去除腐烂及虫蛀部分后带回实验室风干、粉碎、过2 mm筛分后备用。3种凋落物化学组成见表1。二氯甲烷、甲醇、正己烷、无水硫酸钠、中性氧化铝、氯化钾、苯酚、碳酸氢钠、乙酸铵、高锰酸钾、尿素、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、磷酸苯二钠、4-氨基安替比林、2,3,5-三苯基氯化四氮唑、焦性没食子酸、层析硅胶(100～200目)、次氯酸钠(质量分数10%)和过氧化氢(质量分数30%)，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；酶活性测定试剂盒、Biolog Eco板，购自陕西轩宸生物科技有限公司。

表1 3种凋落物的化学组成Table 1 Chemical constitution of three types of litters

1.2 模拟污染土壤的制备

随机选取油污区周边坡地上的裸露地块，随机选取1 m×1 m的样方若干，采集0～10 cm土层土壤。混合均匀后采用5 mm筛去除石砾和动植物残体，以四分法获得约10 kg土壤，并采用质量法确定该土样不含石油污染物[11]。预留部分上述土样用于确定未污染土壤生化性质的初始状态，其余用于模拟污染土壤制备。根据当地实际石油污染程度(含石油质量分数15.40～43.58 g/kg)，选取面积最大的轻度污染区为模拟对象，设定石油污染质量分数为15 g/kg。制备模拟污染土样时，不使用有机溶剂以避免对土壤生化性质的干扰。称取7.2 kg土壤，将108 g石油与2.2 kg土壤充分揉搓混合均匀，随后与剩余5 kg土壤再次混合均匀。制备好的污染土壤静置15 d以使其中污染物达到自然均质化后，采用质量法[11]测得石油残留率为96.80%(实际总石油质量分数为14.5 g/kg，其中饱和烃、芳香烃和非烃物质的质量分数分别为7.4、4.2和2.9 g/kg)。考虑测定误差时，在统计学意义上可以认为均质化后土壤的污染物质量分数不变。预留部分污染土壤用于确定污染对土壤生化性质的干扰后，其余用于后续修复实验。

1.3 对照和处理设置及油污修复土壤实验

分别称量(干重)LD、AG和AS单种凋落物每种3份、3种凋落物混合物3份(LD、AG、AS质量比为1∶1∶1)，共计12份凋落物样品。

设置未污染土壤(未污染土壤直接测定，Unc)和污染土壤(污染物自然均质化15 d后测定，CS)2个对照，采用自然衰减(NA)、LD添加、AG添加、AS添加和混合凋落物添加(Mix)5种处理方式。分别称取400 g油污土壤样品15份，其中3份不添加凋落物作为自然衰减处理样品。其他12份按照凋落物/土壤质量比1/50混合得到凋落物修复样品[7]，按单种凋落物和混合凋落物处理样品分为4组，每组3份。将每份自然衰减或凋落物处理样品置于容积为750 mL的塑料培养钵中，均匀喷入灭菌蒸馏水，调节土壤含水量为饱和持水质量分数50%。利用保鲜膜封口避免土壤水分的蒸发，并在保鲜膜上均匀扎开气孔以为微生物活动提供空气。定期根据失水量(通过质量损失测定)揭开钵口用喷壶补充蒸馏水以保持土壤含水量一致，在20～25 ℃、土壤湿度为饱和水质量分数50%的条件下培养150 d终止。

1.4 石油组分及土壤化学指标的测定

实验结束后，每份样品中取出约200 g，在避光条件下风干并过1 mm筛，然后测定石油及其组分残留量(用以计算降解率)以及土壤化学指标。其中，单位质量(10 g)土壤中的石油残留质量采用超声波萃取-质量法测定。残留石油经正己烷溶解、沉淀后，其中饱和烃、芳香烃和非烃物质的质量采用柱层析分离-质量法测定(经预实验验证，分离过程未造成污染物质量显著损失)[11]。土壤pH值采用玻璃电极法测定(水/土质量比2.5/1)，硝铵态氮、有效磷和速效钾含量分别采用氯化钾浸提-靛酚蓝比色法-紫外光度法、碳酸氢钠浸提-磷钼蓝比色法和乙酸铵浸提-火焰光度法测定[12]。

将回收后各处理预留的约200 g土样(每种处理方法分别制备3份)分别过1 mm筛，直接用于测定土壤酶活性。依据《土壤酶及其研究方法》[13]，蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定，脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，脱氢酶活性采用三苯基四氮唑氯化物比色法测定，多酚氧化酶活性采用邻苯三酚比色法测定，木质素过氧化物酶活性采用2,2′-联氨-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二氨盐(ABTS)比色法测定，漆酶活性采用藜芦醇比色法测定，锰过氧化物酶活性采用硫酸锰比色法测定。除过氧化氢酶活性以反应20 min后滴定残留底物(过氧化氢)消耗的0.01 mol/L KMnO4溶液的体积(mL)表示外，上述酶活性均以单位时间内单位质量土壤(换算为干重，g)中产生的相应催化产物的质量或物质的量表示。

利用Biolog-ECO技术分析土壤微生物群落的代谢(碳源利用)特征。在Biolog Eco测试板上依据贾夏等[14]的方法制备和接种土壤菌液，随后将Eco板在25 ℃下培养240 h，每24 h读取590 nm波长下的光密度值(OD590 nm)。测定完成后，基于培养240 h时读取的数据计算所有31种或特定碳源类型(划分为6大类，包括胺类、氨基酸类、糖类、羧酸类、双亲化合物和聚合物)的平均孔颜色变化率(Average well color development，AWCD)，用以代表微生物的代谢强度。同样基于240 h获取的数据，使用IBM SPSS 23.0软件对数据进行主成分分析，使用Microsoft Office Excel 2019软件计算代谢多样性指数(Shannon-Wiener指数H′和均匀度指数E)。

AWCD=∑(Ci-R)/n

(1)

式(1)中：Ci为第i个非对照孔的吸光值；R为对照孔的吸光值(无量纲)；n为培养基碳源种类数。

H′=-∑Ai-lnAi

(2)

E=H′/lnN

(3)

式中(2)、(3)：Ai为第i个孔的吸光值；N为被利用碳源的总数。

1.5 数据处理

测定结束后，依据式(4)计算土壤样品中石油及其各组分的降解率(Rj，%)。

(4)

在假设不同凋落物处理土壤时不产生相互影响的情况下(即加性效应)，混合凋落物添加处理后土壤石油及其组分降解率或其他土壤生化性质的预测值可以视为3种单独凋落物处理下对应指标值的算术平均[9]。在后续表述中，将其同样视为一种处理方式(记为MixP)以便于统计学分析。

使用SPSS 23.0软件对各处理方式下土壤石油及其组分降解率或土样的化学和生物学指标做单因素方差分析，多重比较采用最小显著差法(LSD)，显著性检验水平为α=0.05。当混合凋落物添加处理后某指标的实测值显著大于对应预测值时，可认为凋落物混合使用时产生显著协同促进作用，使凋落物的修复效果得到强化。其中当针对混合凋落物添加处理后某一指标的实测值同时显著大于任一单种凋落物添加处理下的实测值时，可认为混合处理的强化效应最优。使用SPSS 23.0软件对微生物31种碳源的代谢强度值作主成分分析。绘图使用OriginPro 2021软件完成。

2 结果与讨论

2.1 不同处理方式对土壤中石油及其组分的降解效果

不同处理方式对土壤中石油及其组分的降解效果见图1。由图1可知：自然衰减处理150 d后土壤中的石油降解率为32.44%(概率P<0.05)，其中饱和烃的降解率(41.26%)远高于芳香烃和非烃物质降解率(分别为29.90%和14.20%)；所有凋落物处理均可大幅提高石油降解率(提高了33.09%～42.80%)，其中饱和烃、芳香烃和非烃物质的降解率分别提高了16.54%～38.70%、40.71%～47.94%、46.88%～58.71%(P<0.05)。

NA—Natural attenuation (without litter addition); LD—Lespedeza davurica litter; AG—Artemisia gmelinii litter; AS—Artemisia scoparia litter; Mix—Mixed litter addition withm(LD)∶m(AG)∶m(AS)=1∶1∶1; MixP—Predicted value of mixed litter addition treatment图1 不同处理方式下土壤中石油及其组分的降解率(R)Fig.1 Degradation rates (R) of petroleum in soil and its components in different treatmentsConditions: T=20—25 ℃; Incubation 150 d; 50% of soil saturated water holding capacity

凋落物混用强化去除土壤污染物的能力，使石油降解率实测值比预测值提高了12.16%，其中饱和烃、芳香烃和非烃物质的降解率实测值分别比各自的预测值提高了14.43%、9.24%和10.52%(P<0.05)。且混合凋落物处理对石油、特别是其中芳香烃和非烃物质的降解能力均显著高于任一单种凋落物(P<0.05)，仅对饱和烃的降解能力未超过单种凋落物处理的上限。产生上述现象的原因可能首先是油污土壤处于氮、磷限制状态(不考虑土壤本身碳含量而氮、磷以全量计算时，污染土壤的碳、氮、磷质量比约为100∶5∶5，高于降解微生物的适生范围[2])，凋落物提供的速效氮、磷和其他养分促进了降解菌的增殖和活性的提高，从而加速污染物的降解[2,15-16]。微生物代谢强度与硝态氮含量/饱和烃降解率的正相关关系以及铵态氮含量与非烃类物质降解率的正相关关系均证明了这一推测(Spearman相关系数均大于0.9，P<0.05)。同时，凋落物可释放有机酸等洗脱污染物协助微生物对其的吸收[5,17-18]，或提供萜类、黄酮、酚类和木质素等共代谢底物，诱导木质素降解酶和双加氧酶等的分泌，从而促进石油中难降解芳香环的裂解[19]。然而，单种凋落物难以满足上述所有条件，而混用3种凋落物可以利用化学组成特性的互补通过上述多个途径促进污染物的降解，由此强化其整体的修复能力。例如，凋落物AS和LD能释放的氮、磷、钾、可溶性糖和氨基酸等更多，从而使微生物能获取大量养分和能量加速其生长和代谢，同时其提供的黄酮和多酚较多，能够协助微生物降解污染物[18]；而凋落物AG的木质素含量更高，诱导微生物分泌木质素氧化酶系能力更强[20]，且其提供的萜类共代谢底物也更多[19]。其次，凋落物混用使其化学多样性增加并改善土壤的微环境条件，有利于分解者的生物量积累；而养分和分解抑制物在凋落物间的扩散则可直接提高其总体的可分解性[21]。上述两方面的改变可能导致显著的混合分解非加和效应，加速凋落物分解，从而短时间内补充土壤微生物生长所需的能源和养分，在污染物老化前提高其降解率[15]。此外，不同凋落物基质质量的差异导致其“筛选”出特定的分解者，因而混用凋落物将在相当程度上将增加土壤微生物的多样性[22]。使得具有不同降解能力的微生物可以相互配合降解各种污染物组分，抑或通过自身代谢活动(如氮、磷转化)为其他微生物提供养分支持，从而加快污染物的降解[23]。

2.2 不同处理方式对土壤生物学性质的改善作用

不同处理方式下土壤酶活性的测定结果见表2。由表2可知：石油污染导致土壤脲酶和漆酶活性显著降低，而碱性磷酸酶和多酚氧化酶活性显著提高(P<0.05)；自然衰减导致脲酶和漆酶活性进一步显著降低，使磷酸酶活性显著回落(仍高于对照水平，P<0.05)，且使未受污染影响的过氧化氢酶和木质素过氧化物酶的活性也显著降低。

表2 不同处理方式下的土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activity in different treatments

较之自然衰减，所有单种凋落物处理均显著恢复了脲酶和木质素过氧化物酶活性，并提高了蔗糖酶和脱氢酶活性(P<0.05)。仅LD凋落物显著提高了漆酶活性，其他凋落物则对其产生进一步抑制(P<0.05)。除AS凋落物外，其他凋落物处理显著提高了磷酸酶活性，使之达到污染土样的水平(P<0.05)。

混用凋落物处理对过氧化氢酶和漆酶的活性影响存在协同效应，使前者活性显著高于预测值，且显著高于所有单种凋落物处理(P<0.05)。但混用凋落物处理对蔗糖酶、多酚氧化酶和木质素过氧化物酶活性的影响存在拮抗效应，甚至使多酚氧化酶活性显著低于单种凋落物处理的下限(AG和AS处理，P<0.05)，上述现象与前人在非污染土壤中观察到的结果相似[9,24]。其中，协同效应的产生原因

可能是混合凋落物提供的额外养分刺激了土壤微生物的生长并使其活性提高[2,15-16]，从而增加了过氧化氢酶和漆酶等的分泌(微生物代谢强度与漆酶活性显著正相关，相关系数为0.572，P<0.05)。另外，石油对酶活性的抑制作用部分源于其改变酶的分子构象使其失活，或附着在酶表面阻止其与底物接触[25-28]。而混合凋落物处理下污染物降解加速，解除了其对酶活性的直接抑制或其对底物和酶的包裹，使测得的酶活性有所提高[25,27-28]。再者，有研究表明，混用凋落物处理可能导致土壤中具有降解芳香环能力的微生物的数量比单种凋落物处理显著提高[29]，从而提高相应酶(如漆酶)的活性。而拮抗效应的产生原因首先可能是混用加速了凋落物分解，导致凋落物源次生代谢物(如黄酮和萜类物质)在土壤中快速累积到临界浓度，对微生物的生长和酶活性产生抑制效应，从而使上述酶活性受到相应的拮抗抑制[30]。此外，多酚氧化酶和木质素过氧化物酶等的活性往往与底物的诱导有关[20,31]。由于混合凋落物处理后芳香族污染物降解加速，上述的酶活性可能由于大部分污染物在采样时已经降解，微生物对于相应酶的需求降低而呈现显著降低。例如本研究中，多酚氧化酶与多环芳烃的降解率即呈显著负相关关系(相关系数-0.900，P<0.05)。

当然，石油污染物和凋落物源次生代谢物对土壤酶活性的影响是非常复杂的，两类物质均可作为底物诱导酶活性的提高，同时也可能因其生物毒性对酶活性产生抑制(取决于其在土壤中的含量)。另外即使是同一类酶(如木质素过氧化物酶和漆酶)，由于对底物的选择性以及对污染物耐受能力的差异[32-33]，其活性对混用凋落物处理的响应结果也可能存在差异(前者受到协同促进而后者受到拮抗抑制)。因此，混用凋落物对于污染物降解及凋落物自身化学物质释放速率的改变将通过多个途径影响酶活性，从而使混用凋落物处理对土壤酶活性的影响呈现出协同、拮抗或加性效应等多种结果。

不同处理方式下土壤微生物的碳源利用特征见图2。由图2可知:污染显著提高了土壤微生物的代谢强度(P<0.05，见图2(a))，且增加了其对糖类和聚合物碳源的利用偏好(见图2(b))，自然衰减处理则使其代谢强度显著降低(特别是聚合物，P<0.05)。较之自然衰减处理，凋落物处理普遍显著提高了微生物对6类碳源的代谢强度(特别是凋落物LD，P<0.05)，且增加了其对胺类、羧酸类、双亲化合物和聚合物的利用偏好，使其对6类碳源的代谢强度趋于平均，这与甄丽莎等[34]以及王利彦等[35]对非污染土壤的研究结果类似。其原因可能是凋落物提供的氮、磷养分以及对微生境的改善促进了微生物的生长[2,15]，而其提供的多种底物(如糖类和氨基酸)诱导了微生物对这些底物的利用[34]。

AWCD—Average well color development; Unc—Uncontaminated soil; CS—Contaminated soil; NA—Natural attenuation (without litter addition); LD—Lespedeza davurica litter; AG—Artemisia gmelinii litter; AS—Artemisia scoparia litter; Mix—Mixed litter addition with m(LD)∶m(AG)∶m(AS)=1∶1∶1; MixP—Predicted value of mixed litter addition treatment图2 不同处理方式下土壤微生物的碳源利用特征Fig.2 Characteristics of carbon source utilization by soil microorganisms in different treatments(a) Alterations in the overall metabolic intensity of microbes during incubation; (b) The metabolic ability of microbes on 6 types of carbon sources at 240 h; (c) PCA of the microbial utilization for 31 species of carbon sources based on the data collected at 240 h; (d) The loading of 31 species of carbon sources on the axis PC1 and PC2, names of each carbon source presented in literature[14]Conditions: T=20—25 ℃; 50% of soil saturated water holding capacity

混用凋落物并未使处理后微生物的代谢强度与预测值产生显著差异(P>0.05)，这与污染物降解和酶活性普遍受到显著非加和影响的结果不符。其原因是主要从恢复土壤物质转化功能的角度出发[10]，选择了以简单糖、氨基酸和羧酸类(约占检测碳源的2/3)为主要检测碳源的Biolog Eco板。而由于混用对凋落物碳源种类的改变有限，因而对上述碳源代谢能力的影响较小。在后续研究中，可以通过使用Biolog MT板，增加其他更能反映污染物化学特性的碳源，以更全面地反映混用凋落物对土壤微生物代谢能力的影响。

进一步的主成分分析(PCA)表明，污染明显改变了土壤微生物的碳源偏好(主成分分析中，污染土壤(CS)样品的第二主成分得分(PC2)与未污染对照(Unc)样品的PC2值差异显著，主要反映2种土壤中微生物对D-木糖、i-赤藓糖醇、D-半乳糖酸γ-内酯、L-精氨酸、L-天冬酰胺和腐胺等碳源利用偏好的差异)，而自然衰减处理对其几无影响(见图2(c))。

所有单种凋落物处理均使土壤微生物对糖类和氨基酸类碳源的利用接近未污染状态(见图2(d)，PC2轴)，但同时使其对羧酸类碳源的利用特征与未污染状态下的区别更为明显(见图2(d))。混用凋落物处理后，土壤微生物的碳源偏好则与预测状态以及凋落物AG和AS处理一致。其原因可能是凋落物提供了更多易于利用、且更接近未污染土壤有机质组成的碳、氮源(糖类和氨基酸)[36]。但同时，凋落物分解产生的羧酸类物质使处理后土壤微生物对羧酸类碳源的偏好增加。然而，由于混用并不影响凋落物总体的化学组成，因而混用对土壤微生物代谢偏好的影响也十分有限。

不同处理方式下土壤微生物的碳源利用多样性测定结果见表3。由表3可知，污染导致土壤微生物碳源利用的香农指数显著升高(P<0.05)，而自然衰减处理对其无显著影响(P>0.05)。所有单种凋落物处理均进一步显著提高了微生物代谢多样性，其中LD和AS凋落物处理的提高效果显著优于AG凋落物(P<0.05);混合使用则并未显著改变凋落物对微生物代谢多样性的影响结果(P>0.05)。

表3 不同处理方式下的土壤微生物碳源利用多样性Table 3 Diversity of carbon source utilization by soil microorganisms in different treatments

2.3 不同处理方式对土壤化学性质的影响

不同处理方式下土壤的化学性质见表4。由表4可知：污染导致土壤硝态氮、铵态氮、有效磷含量和pH值显著降低。其原因是微生物降解污染物时需要适宜的碳、氮、磷比例，大量石油污染物碳源的输入迫使微生物消耗土壤氮、磷养分对其进行降解[16]，同时产生的酸性中间产物导致了土壤的酸化[37]。自然衰减处理导致土壤铵态氮和有效磷含量以及pH值进一步显著降低(P<0.05)。所有单种凋落物处理普遍可以大幅提高污染土壤的硝态氮和有效磷含量(P<0.05)，但所有凋落物对于铵态氮含量的恢复能力相对较弱，仅比自然衰减提高14%～72%，并使pH值进一步显著降低。

表4 不同处理方式下土壤的速效养分含量和pH值Table 4 Content and pH value of soil available nutrients in different treatments

凋落物混用使其对土壤化学性质的影响表现出一定拮抗效应，使混合物对土壤硝态氮的补充作用显著低于预测值和单种凋落物处理结果，降低均在20%～29%(P<0.05)范围内，且显著削弱了单种凋落物对土壤的酸化效应(P<0.05)，这与使用混合凋落物处理非污染土壤时的结果相似[9,24,38]。其原因是凋落物对土壤养分的补充作用一方面是由于其直接释放了大量有效态养分，另一方面是由于凋落物处理去除了污染物，因而使得其对养分的固持减少[7]；而微生物的养分转化功能(如固氮、硝化、反硝化和脱磷酸作用等)有所恢复[3, 23]。然而混合凋落物处理下微生物生长和活性超出预期的提高及其对凋落物和污染物的快速降解均需要额外消耗大量的氮，这使得凋落物中释放、甚至是土壤中加速转化而来的速效氮被微生物固定[38]，造成表观上的拮抗效应。值得注意的是，混用并不影响凋落物对土壤铵态氮和速效磷、钾的补充效果，其原因是混合分解不能改变凋落物释放养分的总量，而混用凋落物处理对土壤养分转化功能的促进效果可能有限(如混用凋落物处理时土壤脲酶和磷酸酶的活性与预测值无异)，因而对上述养分的补充效果等于单种凋落物处理的算术平均值。当然，也可能是混用凋落物对土壤速效养分产生的协同补充效应与微生物数量活性增加导致的养分消耗相互抵消，从而无法观察到明显的非加和效应。产生上述现象的具体机理尚需通过测定分析土壤全量养分、微生物氮磷以及土壤速效养分含量及其之间的关系来确定。对于土壤pH值而言，凋落物处理使其降低的原因可能是凋落物自身分解释放了酸性中间产物[37]，而混用加速了凋落物的彻底分解，因而使凋落物处理后土壤pH值的降低幅度减小。当然，上述推测也尚需进一步的研究加以验证。