HPLC法同时测定补益中药中尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷含量分析

张婷婷

江苏省连云港市中医院药学部，江苏连云港 222004

对于生物细胞来说，核苷类成分是其维持生命的一种重要物质，可发挥出免疫调节作用，具有多种药理、生理活性，如对中枢神经产生镇静作用、对脑细胞代谢产生改善作用等。目前，核苷制做为多种药品、食品添加剂及保健品等，于市场上进行销售。同时，在多种补益中药中，如冬虫夏草、灵芝等，核苷类物质是一项重要的质量控制指标[1]。既往研究发现，在多种补益中药中，核苷类成分可能是药物共有的物质基础，但相关研究较少[2]。故本次应用高效液相色谱（high performance liquid chro⁃matography, HPLC）法对熟地黄、当归、人参、麦冬、黄芪及肉苁蓉这6种补益中药中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷含量进行测定，以明确各成分在药物中的实际含量，进而探究补益中药中核苷类成分的重要作用。本研究于2021年1月采用HPLC法同时测定补益中药中各成分含量，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

高效液相色谱仪选用Aglent 1100型设备，包括化学工作站、自动进样器、四元泵等；超纯水制备系统选用Millipore Milli-Q Plus型；平行反应器。

麦冬（生产批号 121013-200908）、黄芪（生产批号 0011024）、熟地黄（生产批号 121196-201406）及肉苁蓉（生产批号 121276-201102）均于药店购买，当归（生产批号 120927-201516）于甘肃岷县购买，人参（生产批号 121586-201202）于吉林抚松县购买，药材经专业人士鉴定，分别为地黄、膜荚黄芪、麦冬、当归、人参、管花肉苁蓉的药用部位。水选取Milli-Q水；由Sigma公司提供对照品，包括腺苷（生产批号 110879-201703）、腺嘌呤（生产批号110886-201102）、鸟苷（生产批号 111977-201501）及尿苷（生产批号 110887-200202），各对照品纯度均>98%。由Merck公司提供乙腈（生产批号130103-201902），且为色谱纯；由广东省光华化学有限公司提供甲酸（生产批号 101414-201902），且为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 制备对照品储备液 称取适量对照品包括腺苷、腺嘌呤、鸟苷及尿苷，注意精准称量，并将其分别放置于量瓶（容量为5 mL）中，将适量水加入溶解对照品，溶解后继续加水稀释浓度，直至达到刻度，充分摇匀后制备对照品储备液，其中腺嘌呤（58.29 μg/mL）、鸟苷（90.73 μg/mL）、尿 苷（77.32 μg/mL）及 腺 苷（157.07 μg/mL）。

1.2.2 制备供试品溶液 精密称定5 g干燥药材粉末（60目筛），准确加入15 ml水后称重，设置平行反应器为100℃，提取时间为90 min，对于失重用水补足，提取液离心处理（转速为13 000 r/min，离心时间为5 min）后将上清液取出，滤过处理所选用滤膜为0.45 μm微孔滤膜，供试品溶液则称取适量续滤液。

1.3 色谱条件

分析柱设置为 250 mm×4.6 mm，5 μm；控制流速为0.5 mL/min；柱温为30℃；检测波长设置为260 nm；进样量设置为15 μL；流动相为0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0~12 min，0%B；12~17 min，0%B~2%B；17~27 min，2%B；27~45 min，2%B~20%B）。于以上色谱条件下对腺苷、腺嘌呤、鸟苷及尿苷进行分离，均达到基线分离，在本研究分析中样品中各个成分除麦冬外，均未对结果产生明显影响，而麦冬成分可对腺嘌呤分析产生一定影响。

2 结果

2.1 考察线性关系

分别对对照品储备液（腺苷、腺嘌呤、鸟苷及尿苷）进行准确量取，加适量水进行稀释，直至成为6个浓度的混合溶液，过滤处理选取0.5 μm微孔滤膜，最后行HPLC分析。线性回归取各对照品峰面积为Y，浓度（μg/mL）为X。各成分的线性关系见表1。

表1 腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷测定结果分析

2.2 考察精密度

于同一天内选取同一份对照品混合溶液，连续进样（次数为6次），计算出各峰面积，并考察日内精密度。进样次数为2次/d，连续测定时间为3 d，计算出各峰面积，并对日间精密度进行考察。分析结果显示，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷的日间精密度RSD（n=6）分别为0.2%、0.5%、1.0%及0.7%；日内精密度RSD（n=6）分别为0.1%、0.1%、0.1%、0%。

2.3 考察重复性

对同一当归样品粉末进行精密称取，各称取0.25 g、0.5 g及0.75 g作为3份样品，以供试品溶液制备方法为依据进行制备，对峰面积进行测定、计算，结果显示，于低、中及高浓度下，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷含量的平均值（n=3）分别为87 μg/g、151 μg/g、270 μg/g及 187 μg/g；RSD 分 别<2.7%、1.4%、2.1%及4.5%。

2.4 考察加样回收率

对已知含量的当归粉末进行精密称取，共称取3份样品，每份剂量约为0.25 g，以原药材中各成分的含有量作为依据，分别称取等量的对照品并加入，按供试品溶液制备方法为依据进行制备，测定加样回收率，结果显示，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷的平均加样回收率（n=3）分别为103.4%、98.3%、97.2%及97.9%；RSD分别为1.7%、0.6%、1.8%及0.8%。

2.5 样品测定结果

各样品粉末均精密称取剂量为0.5 g，制备后将各样品均平行制备2份，以外标法测定腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷含量，见表2。

表2 不同补益中药中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷含量分析

3 讨论

随着临床医学不断发展，中药逐渐受到重视，并被广泛应用于多种疾病治疗中，可取得良好效果。为实现中药现代化，核心就在于质量控制，其中含量测定为关键部分，不仅可用于考察药物内在质量，还能考察药品稳定性，以确保中药制剂的质量，进而决定中药功效[3-5]。中药多数是来自于植物、矿物及动物的非人工制品，且以植物来源最为常见，其化学成分较为复杂，目前多采用色谱法、光谱法测定含量，以HPLC法最为常用[6-8]。HPLC法具有高压、高速、高效、消耗样品少、高灵敏度及易回收等优势，可对药物各成分含量进行精准测定[9]。近年研究发现，在多种补益中药中，核苷类物质均发挥着重要作用[10]。本研究采用HPLC法对不同补益中药中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷含量进行测定，可取得精准结果，结果显示在0.30~77.32 μg/mL、0.35~90.73 μg/mL、0.23~58.29 μg/mL 及0.61~157.07 μg/mL范围内，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷的线性关系均良好；加样回收率分别为103.4%（RSD=1.7%）、98.3%（RSD=0.6%）、97.2%（RSD=1.8%）及97.9%（RSD=0.8%）；当归、人参、熟地黄、肉苁蓉、黄芪及麦冬中均含有核苷类成分，其中黄芪、人参及当归中均含有腺嘌呤、尿苷、腺苷及鸟苷成分，且具有较高含量。张文萌等[11]采用高效液相色谱法同时测定熟地黄中尿苷、腺苷、鸟苷及腺嘌呤等成分含量，结果显示，次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷浓度分别在1.0~16.0 μg/mL(r=0.9999)、5.0~80.0 μ g/mL(r=0.9999)、1.0~16.0 μ g/mL(r=0.9997)、1.25~20.0 μg/mL(r=0.9999)、1.0~16.0 μg/(r=0.9999)范围内线性良好。加样回收率为98.1%～101.0%，与本研究结果一致。分析HPLC法测定补益中药含量的优势如下。①优化提取方法：用水煎煮是以往中药最为常见的使用方法，本次研究中的提取方法也选用了水加热法。在此基础上，首先对提取时间进行考察，分别对当归样品中提取30 min、60 min、90 min及120 min后，计算出各个待测成分的峰面积，并将其进行比较可知，在90 min后各个待测成分的峰面积均未呈显著增加趋势，由此本实验选取90 min作为提取时间。对于溶剂使用量地选取，分别对10倍药材重量、20倍药材重量、30倍药材重量及40倍药材重量体积的溶剂进行考察，发现在待测成分中30倍体积的提取效率最高，由此在样本提取中，选取30倍体积作为溶剂量。②优化色谱条件：研究发现，碱基类化合物具有较大极性，而核苷类化合物与其类似，极性较大[12-13]。因此，在本研究中的色谱分离步骤中，选取Zorbax SB-Aq分析柱，优势在于该种分析柱以纯水作为流动相；同时，比较不同流动相发现，分析物峰形最好的情况是将乙腈-甲酸水溶液作为流动相[14-16]。

对于核苷与补益中药的关系，本研究选取补血药物当归、熟地黄，补气药物黄芪、人参，补阳药物肉苁蓉及补阴药物麦冬作为研究对象，结果发现，在以上补益中药中，核苷类化合物均大量存在，其中核苷类成分含量最高的药物包括当归、黄芪和人参。参照物选取冬虫夏草，以本研究测定结果为依据，结合相关药典中对于各味药材的用量进行计算可见，与冬虫夏草相比较来说，在药典用量下本研究所选取的补益中药所含有的尿苷总量均更高，黄芪中腺嘌呤、鸟苷含量均更高，当归中腺苷含量更高，且在同等用药量情况下，人参中所含腺苷、鸟苷成分均更高[17-18]。

综上所述，核苷类成分属于重要生命物质的一种，具有免疫调节作用，药理、生理活性较强，是多种补益中药中含量较高的活性成分，在其他补益中药如三七、人参、黄芪及当归中也发挥着重要作用，其与补益药物的关系有待进一步研究。