人CYP2C19基因分型检测试剂性能验证*

吕 园，朱莉颖，张 健，李 萍，邬 兰，张秀梅，王海鹏，俞 杨△

1.江苏省南京市第一医院/南京医科大学附属南京医院核医学科实验诊断部，江苏南京 210006；2.江苏省人民医院/南京医科大学第一附属医院血液科，江苏南京 210000

在临床检验过程中，从质量管理的角度考虑，任何一种全新的用于常规检验的检测系统、试剂或方法学，在其投入临床使用前，均需进行相应的性能验证[1]。性能验证能够提高实验室对检测系统、试剂和方法学相关性能指标的认识和理解，对实验室技术质量管理和控制水平的提高具有重要作用[2-3]。本研究参照中国合格评定国家认可委员会(CNAS)2019年2月15日发布并实施的CNAS-GL039：2019《分子诊断检验程序性能验证指南》(以下简称2019版指南)[4]，对人CYP2C19基因分型检测试剂盒[荧光聚合酶链反应(PCR)法]进行方法符合率、检出限、交叉反应以及抗干扰能力4个方面的性能验证[5]。

1 材料与方法

1.1材料 方法符合率：15例临床样本(10例突变型+5例野生型)静脉血；检出限：1例杂合突变型(*2/*3型)临床样本基因组DNA；交叉反应：5例野生型(*1/*1型)临床样本静脉血；抗干扰能力：2例突变型(*2/*3型和*1/*2型)临床样本静脉血。以上基因型均已通过Sanger测序证实。

1.2仪器与试剂 天隆NP968自动化核酸提取仪(西安天隆科技有限公司)；超微量紫外-可见光分光光度计NanoDrop One(赛默飞世尔科技中国有限公司)；SLAN-96P荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)；全自动血液基因组DNA提取试剂(西安天隆科技有限公司)；人CYP2C19基因分型检测试剂盒(荧光PCR法，苏州旷远生物分子技术有限公司)。

1.3静脉血基因组DNA提取 采用天隆NP968自动化核酸提取仪进行静脉血基因组DNA提取。所提取的基因组DNA经超微量紫外-可见光分光光度计NanoDrop One测定，水平为10～100 ng/μL，纯度A260/280值为1.8～2.0。

1.4荧光PCR检测 按照人CYP2C19基因分型检测试剂盒(荧光PCR法)说明书，进行CYP2C19基因分型检测(*2和*3等位基因，c.681G>A和c.636G>A)，同时检测阴性和阳性对照(试剂盒自带)，分为*2G、*2A、*3G和*3A 4个反应体系。用SLAN-96P荧光定量PCR仪及相应配套软件进行荧光定量PCR反应。PCR反应条件：37 ℃ 2 min(去污染)；95 ℃ 3 min(预变性)；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，10个扩增循环；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s※(信号采集点)，65 ℃ 45 s，30个扩增循环，设置检测信号Ct(FAM)/内参信号Ct(ROX)双通道采集荧光信号；25 ℃ 1 min，程序结束，机器冷却至室温。

1.5结果判读 在Ct(ROX)值≤20，且扩增曲线有明显指数增长期的情况下，分别计算样本Ct(FAM)值与Ct(ROX)值的差值，参照说明书判断样本CYP2C19基因型。常见6种基因型结果：CYP2C19*1/*1(636 GG；681 GG)、CYP2C19*1/*2(636 GG；681 GA)、CYP2C19*1/*3(636 GA；681 GG)、CYP2C19*2/*2(636 GG；681 AA)、CYP2C19*2/*3(636 GA；681 GA)、CYP2C19*3/*3(636 AA；681 GG)[6]。

1.6性能验证

1.6.1方法符合率 按照样本检测程序，采用参比方法(金标准Sanger测序法)和候选方法(荧光PCR法)平行检测15例临床样本(突变型10例，野生型5例)[7]静脉血，其中6例为正常样本稀释10倍获得的弱阳性样本(基因组DNA水平约为20 ng/μL)。Sanger测序工作委托华大基因科技有限公司完成。

1.6.2检出限 选取1例杂合突变型(*2/*3型)临床样本基因组DNA。测定其水平为80 ng/μL，纯度A260/280=1.94，将上述基因组DNA梯度稀释5个水平范围，分别为80、40、20、10、5 ng/μL。每个水平稀释后的基因组DNA重复检测5次。

1.6.3交叉反应 选取5例野生型(*1/*1型)临床样本静脉血，分别加入CYP2C19*17等位基因(c.-806C>T)和同源基因CYP2C9(c.1075A>C)突变型质粒，分别重复检测3次。

1.6.4抗干扰能力 选取2例突变型(*2/*3型和*1/*2型)临床样本静脉血，分别稀释10倍获得弱阳性样本(基因组DNA水平约为20 ng/μL)。分别加入终水平为血红素=20.0 g/L，胆红素=60.0 μmol/L，甘油三酯=11.0 mmol/L(厂商声明的最高抗干扰水平)的干扰物质，分别重复检测3次。

2 结 果

2.1方法符合率 15例临床样本检测结果见表1，参比方法(金标准Sanger测序法)和候选方法(荧光PCR法)检测的符合率为100%。

表1 方法符合率结果比对

2.2检出限 杂合突变型(*2/*3型)临床样本基因组DNA经梯度稀释后，其中80、40、20、10 ng/μL 4个水平5次检测结果基因型均为*2/*3型，而5 ng/μL水平4次检测结果基因型为*2/*3型，1次检测无结果。根据试剂盒说明书要求，判定检出限为10 ng/μL。

2.3交叉反应 5例野生型(*1/*1型)临床样本静脉血，分别加入CYP2C19*17等位基因(c.-806C>T)和同源基因CYP2C9(c.1075A>C)突变型质粒，CYP2C19基因分型检测结果仍为*1/*1型，证实交叉反应验证合格。

2.4抗干扰能力 2例突变型(*2/*3型和*1/*2型)临床样本静脉血，在3种干扰物质(血红素/胆红素/甘油三酯)作用下的基因分型检测结果均与对照一致，故试剂盒抗干扰能力合格。

3 讨 论

2019年2月15日CNAS发布并实施了2019版指南[5]，并以此作为分子诊断实验室性能验证的参考文件。此版指南中明确了分子诊断定性检测项目性能验证的指标宜包括“方法符合率、检出限、交叉反应和抗干扰能力”。这对2018版指南中“准确度、测定下限、特异性和抗干扰能力”[8]4个方面性能验证指标进行了明确定义和指导。

关于性能验证样本容量，一直是实验室工作人员最难把握的问题。样本容量又称“样本数”。样本容量是指一个总体的必要抽样的数目[9]。在进行抽样调查时，抽样误差的大小直接影响抽取样本对观察总体的代表性和研究结果的可靠性，而足够的样本单位数目是保证抽样误差不会超过某一指定范围的一个重要因素[10]。2019版指南对定性项目性能验证明确了样本容量的具体要求，为临床提供了参考标准。例如：方法符合率要求，选取阴性样本至少5例、阳性样本(宜包含弱阳性的样本)一般不少于10例。在基因突变检测过程中，通常将野生型样本作为阴性样本，突变型样本作为阳性样本[11]，本研究共选取15例样本，满足2019版指南要求。检出限要求，使用定值标准物质的样本梯度稀释至厂家声明的检出限水平，可重复测定5次或在不同批次内对该水平样本进行20次重复测定(如测定5 d，每天测定4例样本)。本研究选取单日重复测定5次的方案，成功验证厂家声明的检出限水平(10 ng/μL)。交叉反应和抗干扰能力均要求至少重复检测3次以上。

2019版指南明确了应验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测结果的影响[12]。对于报告具体基因型的方法，应在待测核酸水平验证其他基因型对待测核酸测定的影响。本次性能验证试验选取5例CYP2C19*1/*1型临床样本，分别加入CYP2C19*17等位基因(c.-806C>T)和 CYP2C9(c.1075A>C)两种突变型质粒。CYP2C19*17代表c.-806位点，其突变型质粒对本试剂盒检测的c.636和c.681位点结果无影响；而CYP2C9为CYP2C19的同源基因，其c.1075位点突变型质粒对本试剂盒检测结果亦无影响。

在验证试剂盒“检出限”的过程中，本研究将原水平为80 ng/μL基因组DNA梯度稀释为5个水平范围，以求寻找试剂盒最低检测下限[13]。当梯度稀释至10 ng/μL(试剂厂家声称的最低测定下限)时，5次检测结果均与未稀释的样品一致，说明本研究已成功复现了生产厂家所宣称的最低测定下限。当梯度稀释至5 ng/μL时，其中只有4次结果与未稀释的样品一致，且内参扩增曲线的Ct(ROX)值明显增加，接近临界Ct值(20)。第5次结果内参Ct(ROX)值>20，不符合标准操作流程要求，无法判定结果。可能是由于稀释样本中基因组DNA模板水平过低，无法与试剂中引物有效结合[14]。本试剂盒无法保证在5 ng/μL水平100%检出靶核酸，因此判定试剂盒检出限为10 ng/μL。

在验证试剂盒“抗干扰能力”的过程中，本研究选取血红素20.0 g/L，甘油三酯11.0 mmol/L，总胆红素60.0 μmol/L作为3种干扰物质，分别验证溶血、脂血和黄疸3种静脉血样本状态对试剂盒检测结果的影响，相应水平为试剂厂商声称的最高抗干扰水平。结果证实3种干扰物质对检测结果无影响。但在实际临床应用过程中，因大多数患者来自心血管内科，相关药物是否会对检测结果产生影响，值得进一步探讨。

本次性能验证过程严格按照2019版指南对分子诊断基因分型检测的具体要求，实验方案简单明了，可供相关实验室参考。