苦参碱通过TLR3下调PI3K/Akt通路抑制子宫肌瘤细胞的增殖、侵袭和迁移

谭冠 文朱朱 周文静（河南省信阳职业技术学院，信阳 464000）

子宫肌瘤是育龄期妇女常见的良性肿瘤，其症状多样，具有个体差异，临床主要表现为月经过多、阴道出血、习惯性流产、腹部压迫等症状，好发于30~50岁的女性，在育龄期妇女中发病率达20%~30%，且呈逐年升高趋势［1-2］。目前对子宫肌瘤的治疗手段主要有药物治疗、手术治疗与激素治疗，但手术与激素会对患者造成创伤并产生副作用，因此寻找有效的治疗药物具有重要意义。苦参碱是从中药苦参中提取的生物碱，具有免疫调节、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等多种药理活性，研究表明苦参碱能显著抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，并促进肿瘤细胞凋亡和自噬［3］。Toll样受体3（Toll-like receptor 3，TLR3）细胞外跨膜糖蛋白利用细胞信号转导机制诱导免疫反应，在先天性免疫系统中发挥重要作用［4］。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-ki⁃nase，PI3K）是一种重要激酶，与蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）组成信号转导通路PI3K/Akt，在细胞增殖、凋亡等过程中发挥重要作用［5］。研究表明，TLR3可通过PI3K/Akt信号通路调节分枝杆菌RNA诱导IL-10产生［6］。因此，本研究通过探索苦参碱对TLR3和PI3K/Akt通路的影响，进一步探讨苦参碱在抑制子宫肌瘤细胞增殖、迁移与侵袭中的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料RNA提取试剂、LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；TLR3、PI3K、GADPH引物序列由上海生工生物工程有限公司设计合成；pcDNA3.1/TLR3表达质粒及空质粒由广州锐博生物公司设计与合成；1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；BCA试剂盒、RIPA蛋白裂解液、ECL试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）、Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京Solarbio公司；兔抗人TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9、β-actin单克隆抗体购自Abcam公司；山羊抗兔lgG购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 原代子宫肌瘤细胞的培养与鉴定选取2018年10月至2019年8月于信阳职业技术学院附属医院手术切除的10例子宫肌瘤标本，经病理诊断为子宫肌瘤。选取其中1例标本，无菌条件下取肌瘤组织1 cm×1 cm×1 cm，参考文献［7-8］方法鉴定子宫肌瘤细胞，倒置显微镜观察细胞为小梭形，呈放射状生长，采用α-actin抗体进行免疫细胞化学法染色鉴定为子宫平滑肌细胞，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞分组及转染将人子宫肌瘤细胞分为6组，分别为对照组（不做任何处理）、苦参碱低、中、高剂量组（分别用0.5、1.0、2.0 mg/ml苦参碱处理）、pcDNA3.1/TLR3质粒（TLR3）+高剂量苦参碱组（2.0 mg/ml苦参碱处理）、NC组（转染空质粒+2.0 mg/ml苦参碱处理），按照Lipofectamine2000说明书将pcDNA3.1/TLR3质粒和TLR3-NC转染子宫肌瘤细胞转染6 h，荧光鉴定转染成功后更换含2.0 mg/ml苦参碱的培养液继续孵育24 h，每组设置6个复孔，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 RT-qPCR检测TLR3、PI3K mRNA水平使用RNA提取试剂盒提取1.2.2各组细胞总RNA，反转 录 合成为cDNA后，RT-qPCR检 测TLR3、PI3K mRNA的相对表达量。以GADPH为内参，采用2-ΔΔCt法分别计算TLR3、PI3K mRNA相对表达量。TLR3、PI3K、GADPH引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 细胞增殖实验通过CCK-8法检测1.2.2各组子宫肌瘤细胞增殖情况，按照试剂盒说明书操作，酶标仪测定吸光度值（A），实验重复3次，细胞存活率（%）=（A实验组/A空白对照组）×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡取1.2.2各组细胞培养48 h后，用0.25%EDTA胰酶消化细胞，PBS冲洗后将细胞制成悬液，加入10μl Annexin VFITC和5μl PI混匀，避光孵育10 min，上流式细胞仪检测。

1.2.6 细胞划痕实验收集1.2.2各组对数生长期细胞，以1×106个/孔接种于6孔板，待各组子宫肌瘤细胞长满80%后，用20μl移液器枪头在6孔板垂直划痕，D-hanks液洗去除飘落细胞，加入培养基培养36 h，随机选择3个×100视野，倒置显微镜拍照，测量划痕距离，计算平均值。迁移率（%）=（0 h划痕距离-36 h划痕距离）/0 h划痕距离×100%。

1.2.7 细胞侵袭实验Transwell检测各组细胞侵袭情况，培养基与基质胶按照体积比8∶1混匀后，以50μl/孔均匀铺在Transwell小室上室，37℃培养箱内培养4 h后吸去培养液待用，小室上室加入200μl单细胞悬液，下室加入650μl含10%FBS的培养液，培养24 h后取出小室，棉签拭去上室细胞后，PBS冲洗，0.5%结晶紫染色，倒置光学显微镜下观察并拍照，计算穿膜细胞数。

1.2.8 Western blot检测TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表达收集1.2.2各组细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳后将凝胶上的蛋白转至PVDF膜，以5%的BSA室温封闭2 h，加入一抗TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9和β-actin（1∶1 000），4℃孵育过夜，HRP标记的羊抗小鼠IgG与羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育30 min，滴加ECL发光试剂，暗室曝光显影，分析条带灰度。

1.3 统计学方法以统计学软件SPSS22.0分析实验数据，计量资料以±s描述，多组间比较使用单因素方差分析，进一步两组间比较行SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代子宫肌瘤细胞的培养与鉴定HE染色显示，子宫肌瘤组织可见炎症细胞浸润，细胞呈圆形或椭圆形，核仁明显，免疫组化显示α-actin抗体呈阳性（图1）。细胞生长曲线显示扩增出的原代子宫肌瘤细胞增殖能力良好。

图1 原发性子宫肌瘤的培养与鉴定Fig.1 Culture and identification of primary uterine fibroids

2.2 苦参碱对子宫肌瘤细胞增殖与凋亡的影响

与对照组相比，苦参碱低、中、高剂量组子宫肌瘤细胞存活率降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与苦参碱高剂量组相比，TLR3+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞存活率升高，差异有统计学意义（P<0.05），TLR3-NC+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞存活率差异无统计学意义（图2A，P>0.05）。与对照组相比，苦参低、中、高剂量组子宫肌瘤细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与苦参碱高剂量组相比，TLR3+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05），TLR3-NC+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05，图2B、C）。

图2 苦参碱对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响Fig.2 Effects of matrine on proliferation and apoptosis of uterine leiomyoma cells

2.3 苦参碱对子宫肌瘤细胞迁移、侵袭能力的影响与对照组相比，苦参碱低、中、高剂量组子宫肌瘤细胞迁移率降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与苦参碱高剂量组相比，TLR3+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞迁移率升高，差异有统计学意义（P<0.05），TLR3-NC+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞迁移率差异无统计学意义（P>0.05，图3A、C）。Transwell结果显示，与对照组相比，各药物干预组细胞侵袭率降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与苦参碱高剂量组相比，TLR3+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞侵袭率升高，差异有统计学意义（P<0.05），TLR3-NC+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞侵袭率差异无统计学意义（P>0.05，图3B、D）。

图3 苦参碱对子宫肌瘤细胞迁移、侵袭的影响Fig.3 Effects of matrine on migration and invasion of uterine leiomyoma cells

2.4 苦参碱对子宫肌瘤细胞部分基因表达的影响与对照组相比，苦参碱低、中、高剂量组TLR3 mRNA与PI3K mRNA水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与苦参碱高剂量组相比，TLR3+苦参碱高剂量组TLR3 mRNA与PI3K mRNA水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），TLR3-NC+苦参碱高剂量组TLR3 mRNA与PI3K mRNA水平差异无统计学意义（P>0.05，图4A）。与对照组相比，苦参碱低、中、高剂量组TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与苦参碱高剂量组相比，TLR3+苦参碱高剂量组TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05），TLR3-NC+苦参碱高剂量组子宫肌瘤细胞蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05，图4B、C）。

图4 各组细胞相关基因mRNA和蛋白表达水平Fig.4 mRNA and protein expression levels of cell related genes in each group

3 讨论

子宫肌瘤是女性生殖系统常见肿瘤，目前对于子宫肌瘤的根治尚无有效药物，手术为治疗子宫肌瘤的主要手段，对育龄期女性而言，药物治疗为首选。子宫肌瘤的发病与其细胞增殖、侵袭等相关，因此寻找可有效抑制子宫肌瘤细胞增殖、迁移与侵袭的药物对子宫肌瘤的治疗具有重要意义［9-10］。

苦参碱被广泛应用于抗肿瘤领域研究，主要通过抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移诱导肿瘤细胞凋亡。YANG等［11］研究表明，苦参碱可剂量和时间依赖性地抑制非小细胞肺癌细胞的增殖活性，苦参碱可阻断PAX2表达，从而干扰上皮-间质转化信号通路，从而抑制非小细胞肺癌细胞在体外的迁移和侵袭。本研究发现，使用苦参碱处理子宫肌瘤细胞后，细胞增殖活性、迁移与侵袭能力降低，凋亡率增高，表明苦参碱能够抑制子宫肌瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，然而其具体机制尚不明确。PI3K/Akt信号通路是存在于多种细胞内的一条重要信号通路，在调控肿瘤细胞增殖、侵袭等方面发挥功能，与肿瘤的发生、转移、侵袭、化疗耐药等密切相关［12］。柯小平等［13］研究表明，前列腺素E2（PGE2）/前列腺素E2受体（PGE2-R）通过介导P13K/Akt信号途径参与调控子宫肌瘤发病，表明P13K/Akt信号通路与子宫肌瘤发生有关。研究表明，苦参碱可通过P13K/Akt信号通路抑制细胞增殖，调节细胞耐药性［14］。PENG等［15］研究表明，苦参碱可通过PI3K/Akt/UPA途径显著抑制胃癌细胞的增殖和转移。本研究结果显示，苦参碱处理子宫肌瘤细胞后，细胞P13K、Akt mRNA及蛋白水平降低，表明苦参碱可下调P13K/Akt信号通路，抑制细胞的增殖、迁移与侵袭。

TLR3是TLR家族的重要成员之一，是识别病毒和哺乳动物细胞双链RNA（dsRNA）的受体。TLR3与其配体结合后，可启动信号转导功能诱导炎症细胞因子释放，参与非特异性免疫反应［16］。研究表明，TLR3的表达与肝癌细胞的增殖、凋亡和血管再生有关［17］。本研究结果显示，苦参碱处理子宫肌瘤细胞后，细胞TLR3 mRNA及蛋白表达水平降低，表明苦参碱可抑制TLR3表达。研究证实，TLR3通过PI3K/Akt通路发挥其功能，其在CD34（+）细胞、巨核细胞和血小板中表达，TLR3激动剂可激活NF-κB、PI3K/Akt通路［18］。FAN等［19］研究表明，TLR3在体内外实验中均能抑制乳腺癌细胞增殖，其介导的增殖抑制是通过下调EGFR/PI3K/Akt通路引起的。本研究结果显示，与苦参碱高剂量组相比，使用TLR3转染细胞后，子宫肌瘤细胞的TLR3、PI3K、p-Akt表达均升高，而TLR3-NC+苦参碱高剂量组TLR3、PI3K、p-Akt表达变化不显著，提示苦参碱可能通过抑制TLR3表达来下调PI3K/Akt通路，从而抑制子宫肌瘤细胞的增殖、迁移与侵袭。

综上所述，苦参碱通过抑制TLR3表达下调PI3K/Akt通路，抑制子宫肌瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，为临床治疗子宫肌瘤提供了新的方向。但其具体机制尚不明确，本课题组将联合动物模型对苦参碱的作用机制做进一步研究。