激活受体PPAR-γ调节压力超负荷诱导的大鼠心肌纤维化的研究①

王丹 卢迎宏 井海云王梦超李智慧包晓青陈文哲刘凯邢瑞星

（郑州大学附属郑州中心医院心血管内科，郑州 450007）

心肌肥厚是多种心血管疾病发生发展过程中共同的病理特征，心肌细胞体积增大，成纤维细胞的活化导致胶原、纤连蛋白等细胞外基质异常沉积是其主要的病理生理变化。心肌肥厚作为一种机体代偿性改变，随着病情的逐渐加深，会逐渐进展为失代偿性心力衰竭［1］。随着生活水平及饮食习惯的改变，高血压患者日益增多，持续高血压引起的慢性压力超负荷心功能不全逐渐引起人们的关注。过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）作为核激素受体家族的成员之一，是配体激活的一类转录因子，主要参与调解炎症反应在内的多种生物学功能［2］。有研究证实其主要通过抑制心肌炎症反应进而在心肌缺血再灌注损伤中发挥保护效应［3］。炎症反应是诱发心肌纤维化的因素之一，促炎因子分泌增多可活化心肌成纤维细胞，促进心肌细胞损伤或坏死，损伤心功能。基因治疗是通过将功能明确的基因以载体导入病灶部位，对靶点区域部位的功能异常进行修复、补偿和校正，进而恢复相关区域正常生理功能［4］。慢病毒载体作为一类使用较多的用于基因表达与治疗的缺陷型载体，具有稳定表达、较低免疫性及外源基因容量大的优点，在心血管疾病等基因治疗中广泛应用［5-6］。PPAR-γ作为已知参与心肌异常的心血管炎症疾病的发展环节的转录因子，为了探索PPAR-γ与压力超负荷诱导的大鼠心肌细胞重塑的相关性［7］。本研究通过构建携带PPAR-γ的慢病毒载体，并用该载体对压力超负荷大鼠进行治疗，观察其对大鼠心肌纤维化的影响，以期为压力超负荷引起的心功能不全治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性6周龄SD大鼠40只，体质量260~280 g，购于济南金丰实验动物有限公司［生产许可证号：SCXK（鲁）2018-0006］，于恒温（22±2）℃、恒湿（55±5）%，SPF级饲养环境进行常规饲养。所有操作程序经伦理委员会批准。

1.1.2 试剂和仪器Lv-NC、Lv-PPAR-γ慢病毒载体的构建包装纯化均委托上海吉凯生物技术有限公司完成；TRIzol提取液购自美国Invitrogen公司；反转录相关试剂购自日本TaKaRa公司；SYBR Green Mix试剂盒购自美国LifeTech-nology公司；总蛋白RIPA裂解液购自美国ThermoFisher公司；PPAR-γ、α-滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、IL-10、IL-1β、IL-4、IL-6的PCR引物委托上海生物工程股份有限公司设计并合成；兔抗大鼠PPAR-γ、α-SMA、TGF-β、FN、iNOS、IL-10、β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；酶标仪、蛋白印迹电泳仪购自美国Bio-Rad公司；荧光定量PCR扩增仪购自美国Thermo Fisher公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；超声心动图系统购自美国GE Health⁃care公司；BL-410生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物的模型建立、分组及处理将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、Lv-NC组和Lv-PPAR-γ组，每组10只。在恒温（22±2）℃、恒湿（55±5）%，SPF级饲养环境下适应性喂养1周后，给予3 ml/kg的水合氯醛麻醉后仰面固定在操作台，常规消毒备皮后，沿腹部中线打开腹腔，小心地将腹主动脉分离，并用直径0.7 mm的21G针头沿腹主动脉平行位置放置，然后用4号手术线从腹主动脉背侧p穿出，将针头与腹主动脉共同结扎后，迅速移去针头，形成50%~70%腹主动脉缩窄，之后关闭腹腔，假手术组大鼠仅打开腹腔，不结扎手术线［8］。完成手术后3 d，Lv-NC组和Lv-PPAR-γ组大鼠分别尾静脉注射20μl 1×109TU/ml Lv-NC、Lv-PPAR-γ，假手术组、模型组注射等量生理盐水。常规饲养4周后进行相关指标测定。

1.2.2 大鼠心功能检测完成实验后，将各组大鼠以三溴乙醇114 mg/kg腹腔注射麻醉后，使用超声心动图系统进行超声心动图检测，从图像中测量前壁和后壁的厚度，记录中测量左心室舒张末期直径（LVEDD）和左心室收缩末期直径（LVESD），测定5个心动周期，并计算左室短轴缩短率（FS），计算公式为：FS（%）=（LVEDD-LVESD）×100/LVEDD×100%。测量完成后，大鼠取仰卧位，分离右颈部动脉，将充满肝素的生理盐水聚苯乙烯左心导管插入左心室，采用BL-410生物机能实验系统检测大鼠的心率（HR）及左心室收缩压（LVSP）。

1.2.3 血清心肌损伤标志物水平检测心功能检测完成后，腹主动脉取血，分离血清，利用ELISA试剂盒检测血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb水平。

1.2.4 心肌组织HE染色及Masson染色称重断头处死大鼠，取出心脏，用预冷的生理盐水将血液等冲洗干净，置于干净的滤纸上吸干多余水分，沿房室交界处去除左右心房，保留左心室称量后，将心脏标本分为2份，一部分用锡纸包裹置于液氮中速冻，保存于-80℃超低温冰箱用于后续RT-PCR及Western blot检测。一部分置于4%多聚甲醛内固定24 h，常规脱水，透明，包埋，切片后，按照HE试剂盒说明进行染色，显微镜下各组大鼠心肌组织病理改变。另取部分切片根据Masson试剂盒说明书添加染液，分化，脱水，透明，封片。在倒置荧光显微镜下观察胶原沉积，并使用Image-ProPlus 6.0软件计算胶原容积分数（CVF）。

1.2.5 RT-PCR检测心肌组织中相关基因mRNA表达取1.2.3中保存的心肌组织样品，按照总RNA提取试剂盒说明书上操作步骤提取总RNA，提取后用紫外分光光度计检验，OD值（A260/A280）=1.8~2.0，并用凝胶电泳检测RNA的完整性。将符合要求的低mRNA按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。反转录体系（10μl）：2×miRNA反应混合液5μl、0.1%BSA 1μl、miRNA PrimeScript®RT酶混合物1μl、总RNA 0.5μl、去RNA酶ddH2O 2.5μl。反应条件设置：37℃60 min，85℃5 s，4℃30 min。PCR体系10μl：SYBR®Prmix Ex TapⅡ（2×）5μl、正向引物0.4μl、反向引物0.4μl、ROX Reference DyeⅡ（50×）0.2μl、cDNA 1μl、ddH2O 3μl。详细操作见试剂盒说明书。PCR反应参数设置：50℃激活聚合酶5 min，95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸34 s，反应进行40个循环。溶解曲线绘制：95℃15 s，60℃60 s，85℃15 s，60℃15 s。每个样孔设置3个复孔。用2-ΔΔCt法计算mRNA表达。

1.2.6 Western blot检测心肌组织中相关蛋白表达取冻存的心肌组织于冰上研磨成粉末，加入RIPA裂解液后提取总蛋白，采用BCA法对蛋白水平进行定量，并利用Bradford调整各组蛋白浓度一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至甲醛预处理过的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗鼠PPAR-γ、α-SMA、TGF-β、FN、iNOS、IL-10、Actin（1∶500）一抗4℃孵育过 夜，TBST漂 洗40 min，加 入HRP标 记 的 二 抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，使用ECL试剂盒在DNR Bio Imaging System上观察膜上蛋白条带，收集影像，采用Image J软件对各组条带灰度值进行半定量分析。

1.3 统计学处理采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，若正态分布、方差齐，采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Lv-PPAR-γ转染效率的鉴定如图1所示，模型组大鼠心肌组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达水平较假手术组均显著降低（P<0.05）；模型组与Lv-NC组大鼠心肌组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达水平表达差异无统计学意义（P>0.05）；Lv-PPAR-γ组大鼠心肌组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达水平较模型组显著升高（P<0.05）。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达水平Fig.1 Expression levels of PPAR-γmRNA and protein in myocardial tissues of each group

2.2 各组大鼠心室功能指标比较模型组大鼠HR、LVSP、FS水平较假手术组均显著降低（P<0.05）；模型组与Lv-NC组大鼠HR、LVSP、FS水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；Lv-PPAR-γ组大鼠HR、LVSP、FS水平较模型组显著升高（P<0.05，表1）。

表1 各组大鼠心室功能指标比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of ventricular function indexes of each group（±s，n=10）

表1 各组大鼠心室功能指标比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of ventricular function indexes of each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Sham Model Lv-NC Lv-PPAR-γ HR/（beat·min-1）411.32±30.73 212.46±21.521）215.18±22.68 334.29±38.282）LVSP/mmHg 131.66±23.29 55.72±7.171）52.19±8.54 120.13±12.272）FS（%）29.19±2.26 7.91±1.641）8.03±2.43 22.18±2.632）

2.3 各组大鼠血清心肌损伤标志物水平比较模型组大鼠血清中CK-MB、Mb、cTnⅠ水平较假手术组均显著升高（P<0.05）；模型组与Lv-NC组大鼠血清中CK-MB、Mb、cTnⅠ水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；Lv-PPAR-γ组大鼠血清中CK-MB、Mb、cTnⅠ水平较模型组显著降低（P<0.05，表2）。

表2 各组大鼠血清心肌损伤标志物水平比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison on levels of myocardial injury markers in each group（±s，n=10）

表2 各组大鼠血清心肌损伤标志物水平比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison on levels of myocardial injury markers in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Sham Model Lv-NC Lv-PPAR-γ CK-MB/（U·L-1）24.29±5.38 111.37±16.281）113.68±19.34 46.41±10.242）Mb/（ng·ml-1）22.28±4.27 125.47±23.481）126.83±19.02 58.22±7.582）cTnⅠ/（ng·ml-1）0.15±0.04 0.68±0.091）0.69±0.07 0.31±0.062）

2.4 各组大鼠左心HE染色结果比较如图2所示，假手术组大鼠心肌细胞、心肌纤维无异常，纹路清晰；模型组和Lv-NC组大鼠心肌纤维排列紊乱，横纹难以辨别，可见少量心肌断裂，核固缩；Lv-PPAR-γ组大鼠心肌排列紊乱明显改善，可以看出横纹，肌纤维肿胀也有所改善。

图2 各组大鼠心肌组织HE染色结果（×400）Fig.2 HE staining results of rats myocardial tissues in each group（×400）

2.5 各组大鼠左心Masson染色结果比较如图3所示，模型组和Lv-NC组大鼠心肌细胞可见大量蓝色胶原纤维沉积，且模型组CVF水平较假手术组显著升高（P<0.05）；Lv-PPAR-γ组大鼠心肌细胞胶原沉积明显减少，心肌纤维化程度降低，且CVF水平较模型组显著降低（P<0.05）。

图3 各组大鼠心肌组织Masson染色结果（×400）Fig.3 Masson staining results of rats myocardial tissues in each group（×400）

2.6 各组大鼠心肌组织中纤维化标志物表达水平比较如图4所示，模型组大鼠心肌组织中α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相对表达水平较假手术组均显著升高（P<0.05）；模型组与Lv-NC组大鼠心肌组织中α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相对表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；Lv-PPAR-γ组大鼠心肌组织中α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相对表达水平较模型组显著降低（P<0.05）。

图4 各组大鼠心肌组织中纤维化标志物mRNA及蛋白表达水平Fig.4 Expression levels of fibrosis markers mRNA and protein in myocardial tissues of each group

2.7 各组大鼠心肌组织中炎症相关因子表达水平比较如图5所示，模型组大鼠心肌组织中iNOS、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-4 mRNA及iNOS、IL-10蛋白相对表达水平较假手术组均显著升高（P<0.05）；模型组与Lv-NC组大鼠心肌组织中iNOS、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-4 mRNA及iNOS、IL-10蛋白相对表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；Lv-PPAR-γ组大鼠心肌组织中iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA及iNOS蛋白相对表达较模型组显著降低（P<0.05），IL-10、IL-4 mRNA及IL-10蛋白相对表达水平较模型组显著升高（P<0.05）。

图5 各组大鼠心肌组织中炎症相关因子表达水平比较Fig.5 Comparison on expression levels of inflammationrelated factors in rats myocardial tissues of each group

3 讨论

心肌肥厚是机体应对压力负荷过重的一种代偿机制，通过增加心肌总量使得心脏收缩能力增强，进而维持心脏的正常血液循环，但由于肥大的心肌会增加耗氧量，冠状动脉又无法提供足够的供血，长期如此会导致心肌缺血，而引起代偿性心力衰竭发生［9］。虽然目前诸多研究表明PPAR-γ在心肌肥厚等多种心血管疾病中发挥着重要作用［10-11］，但其具体的分子机制仍有待探索。压力负荷性模型是心血管疾病研究的常用模型之一，其中腹主动脉缩窄是建模较为理想的一种［12］。本研究通过采用腹主动脉缩窄术构建心室肥厚大鼠模型，发现模型大鼠心脏组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达水平均显著降低，提示PPAR-γ很有可能成为治疗压力超负荷性心功能不全的有效靶标。慢病毒载体是目前基因治疗载体研究的热点方向，其对分裂和非分裂细胞均有较高的感染能力，从而在体内获得长期表达，并且安全性好［13］。本研究结果显示通过尾静脉注射包装完成的携带PPAR-γ基因的载体后，能够显著提高模型大鼠心肌组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达水平，表明慢病毒介导的过表达可以有效提高心肌组织中PPAR-γ表达水平。

本研究结果发现，模型组大鼠HR、LVSP、FS水平均显著降低，并且血清心肌损伤标志物CK-MB、Mb、cTnⅠ水平显著升高，而感染Lv-PPAR-γ组大鼠HR、LVSP、FS水平均有所改善，并且CK-MB、Mb、cTnⅠ水平显著降低，表明稳定表达PPAR-γ能够改善压力超负荷大鼠左心室功能，减轻心肌损伤。HE染色结果显示，模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，横纹难以辨别，可见少量心肌断裂，核固缩，并且存在少量炎症细胞浸润。Masson染色结果显示，胶原沉积显著升高，而感染Lv-PPAR-γ后大鼠心肌排列紊乱明显改善，横纹及纤维肿胀也有所改善，并且胶原沉积也显著降低。炎症反应在心力衰竭等心血管疾病的发病机制中发挥重要的作用，而炎症因子引起的损伤会进一步导致心肌成纤维细胞的迁移及增殖，心肌组织的修复及纤维化必不可少［14］。α-SMA是肌成纤维细胞的特征性标志物，也是成纤维细胞具有收缩活性的基础［15］；FN则是细胞外基质的主要成分，前者可诱导胶原的形成，促进脏器纤维化［16］；TGF-β是目前研究发现致纤维化细胞因子中重要的一种调控因子，它能够诱导α-SMA、COLIA1、Vimentin等纤维蛋白的合成，同时TGF-β还可以通过与相应的受体相结合，刺激活化成纤维细胞，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，大量分泌细胞外基质，最终导致纤维化［17-18］。本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织中α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相对表达水平均显著升高，而感染Lv-PPAR-γ后α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相对表达水平显著降低，表明PPAR-γ可能通过抑制α-SMA、TGF-β、FN表达，从而抑制心肌组织纤维化。

iNOS是心肌组织中存在的3种类型NOS其中之一，正常情况下其表达量较低，但在病理相关刺激诱导下大量合成，参与机体防御反应，但同时也具有细胞毒性作用，会引起心肌细胞损伤［19］；IL-1β、IL-6是由活化单核细胞合成的促炎症细胞因子，能促进T、B细胞的增殖活化以及免疫球蛋白的产生，同时还能够作为内生致热源参与炎症反应及促急性时相蛋白合成［20］；IL-4、IL-10则主要是由Th2细胞分泌的一类抗炎症细胞因子，通过抑制巨噬细胞的提呈功能来降低机体的炎症反应［21］。本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织中促炎症细胞因子iNOS、IL-1β、IL-6表达显著升高，而抗炎症细胞因子IL-4、IL-10水平也显著升高，这主要是因机体自身调控炎症细胞因子水平的负反馈调节机制，从而抑制过度炎症反应，抗炎症细胞因子也显著升高。感染Lv-PPAR-γ后，心肌组织中iNOS、IL-1β、IL-6表达显著降低，IL-4、IL-10水平显著升高，表明PPAR-γ能够通过抑制炎症细胞因子的释放进而缓解超负荷大鼠各种病理表征。相关研究表明，在压力超负荷大鼠体内，RNA干扰NF-κB信号通路P65后可缓解压力应激引起的心肌损伤，而新发现的PPAR-γ激动剂能够通过抑制NF-κB上游的ⅠκB激酶磷酸化来抑制NF-κB信号通路［22-23］。因此，本研究推测PPAR-γ可能通过抑制NF-κB信号通路激活，抑制下游炎症细胞因子合成，并促进抗炎症细胞因子合成，从而减轻对心肌细胞的炎症损伤，并降低心肌组织内胶原的异常沉积，进而缓解压力超负荷引起的心肌肥厚与功能损伤。

综上所述，本研究采用慢病毒介导的过表达PPAR-γ压力超负荷动物模型试验，提示心肌组织中稳定表达PPAR-γ可缓解压力超负荷引起的心肌肥厚与功能损伤，其机制可能与抑制炎症细胞因子释放，降低心肌组织内胶原异常沉积有关。