基于HMGB1/Beclin-1信号通路探讨温阳利水通络法对肾病综合征模型小鼠TNF-α、IL-4、IL-8的作用机制①

吴鹏公 敏黄琳 曾冬梅 吴洪皓 邱家廷（江西省赣州市中医院，赣州 341000）

肾病综合征是由感染、遗传、免疫等多种病因引起的临床肾脏疾病综合征，其主要临床症状表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿和高脂血症等［1-3］。肾病综合征往往伴有肾小球滤过膜损伤、肾小球基膜通透性增加等病理生理状态，其病因复杂多变，患病率和发病率也呈逐年增长趋势［4-5］。micro RNAs是一种小型非蛋白质编码的单链RNA，在组织中转录调控目标基因表达。相关资料记录到，microRNA参与了包括细胞发育、凋亡和自噬在内的一系列过程［6-7］。现有研究表明，miR-141与HMGB1/Beclin-1间的平衡是影响肾病综合征发生发展的重要原因［8］。肾病综合征的治疗以糖皮质激素、烷基化剂及环孢霉素等免疫抑制剂预防、延缓肾功能进行性恶化为主，这些疗法虽能缓解临床症状、预防并发症，但均出现不良反应［9］。目前，中医药在治疗肾病综合征上具有一定的优势。温阳利水通络法是中医药方，具有温阳利水的功效，本文旨在研究温阳利水通络法调控HMGB1/Beclin-1信号通路对肾病综合征的治疗效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物30只小鼠［许可证号：SCXK（京）2016-0006；伦理号：IACUC-DWZX-2020-627］，雄性，SPF级，体质量（30±2）g，购于医学实验动物基地，集体饲养，鼠笼安静整洁，室内温度保持在15~25℃，空气流通干燥。

1.1.2 药品及试剂茯苓30 g、黄芪30 g、银杏叶20 g、附子15 g、白术15 g、赤芍15 g、红参10 g、猪苓10 g、川芎10 g、干姜10 g、甘草6 g，置于凉水中浸泡1 h，煎煮30 min后浓缩为2 g/ml。盐酸阿霉素（25316-40-9，深圳万乐药业有限公司），兔抗小鼠HMGB1抗体，山羊抗小鼠Beclin-1抗体，兔抗小鼠LC3（英国Abcam公司）；TNF-α、IL-4、IL-8 ELISA Kits（北京百智生物科技公司）。

1.1.3 仪器全自动生化分析仪（BK-200，江苏英诺华医疗技术有限公司）；裂解液（NONE6960，上海申友生物公司）；染色试剂盒（G1120-100，北京索莱宝科技有限公司）；光学显微镜（XTL，美国Nikon公司）；包埋机（BK-TEⅠ，LEICA公司）；烤片机（E0991，Leica公司）；切片机（E0974，Leica公司）；酶标仪（BIOBASE-EL10A，上海闪谱生物科技公司）；蛋白电泳仪（112-0830，美国Bio-Rad公司）；转膜仪（TY-20101，上海天能科技有限公司）；高速离心机（TG-16W-Ⅰ，Eppendorf公司）；凝胶成像仪（LGDL-96，美国Life Technology公司）

1.2 方法

1.2.1 动物造模模型组和温阳利水通络法组小鼠采用尾静脉注射6.5 mg/kg盐酸阿霉素建立肾病综合征模型，小鼠24 h尿蛋白明显增加即为建模成功，对照组小鼠注射等剂量生理盐水。造模结束后第5天开始用药，温阳利水通络法组小鼠20 g/（kg·d）灌胃（温阳利水通络法共煎制200 g）。根据临床实际，选择小鼠与人的等效剂量的倍数为5.98。处方总剂量200 g，如果给体质量60 kg的成人每日服用1剂，即成人剂量3.33 g/（kg·d），则小鼠等效剂量为19.93 g/（kg·d），约为20 g/（kg·d），对照组、模型组小鼠采用同剂量蒸馏水灌胃，1次/d，连续3周。

1.2.2 检测小鼠肾功能指标取小鼠血、尿样，检测肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitro⁃gen，BUN）及24 h尿蛋白量。

1.2.3 HE染色观察小鼠肾组织病理变化给药停止24 h后，小鼠腹腔注射戊巴比妥断头处死，取其肾组织，在10%福尔马林中固定48 h，经过脱蜡、包埋、切片，切片水化后制成玻片标本，加入Mayer's苏木精在室温下孵育10 min，加入0.5%曙红溶液室温下孵育3 min，镜下观察。

1.2.4 肾组织病理评分0分：肾组织各部分正常，没有肿大及炎症；1分：肾组织各部分不清晰，出现轻微肿大及炎症情况；2分：肾组织出现严重肿大，炎症反应明显；3分：肾组织损伤明显，边界不明，炎症加剧。

1.2.5 小鼠TNF-α、IL-4、IL-8表达血样离心取上清液，检测TNF-α、IL-4、IL-8水平。

1.2.6 Western blot检测小鼠肾组织相关蛋白表达水平肾组织裂解缓冲，测定总蛋白。电泳分离等量蛋白质，4℃下添加一抗孵育过夜，洗涤后添加二抗，显影后分析蛋白水平。

1.3 统计学分析采用统计学软件SPSS21.0分析数据，以±s记录，采用t或F检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肾功能指标模型组小鼠CRE、BUN、24 h尿蛋白量高于对照组；温阳利水通络法组CRE、BUN、24 h尿蛋白量低于模型组，见表1。

表1 肾功能指标水平（±s，n=10）Tab.1 Renal function index level（±s，n=10）

表1 肾功能指标水平（±s，n=10）Tab.1 Renal function index level（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P CRE/（mg·dl-1）0.53±0.06 1.49±0.201）0.72±0.092）150.614 0.000 BUN/（mg·dl-1）18.02±2.31 47.06±4.631）24.93±4.022）160.617 0.000 24 h urine protein level/（mg·dl-1）24.02±3.03 79.35±4.711）35.85±3.632）571.416 0.000

2.2 肾组织病理对照组小鼠肾小球，肾小囊清晰可见，无异常（图1A）；模型组小鼠肾小球形态异常肿大，肾小囊皱缩，基底膜加厚伴系膜基质变多，边界模糊（图1B）；温阳利水通络法组小鼠肾小球形态改善，肿大减小，肾小囊皱缩缓解（图1C）。

图1 肾组织病理变化（×200）Fig.1 Pathological changes of kidney tissue（×200）

2.3 肾组织病理评分模型组小鼠肾组织病理评分增加高于对照组；温阳利水通络法组肾组织病理评分低于模型组，见表2。

表2 肾组织病理评分（±s，n=10）Tab.2 Renal histopathological score（±s，n=10）

表2 肾组织病理评分（±s，n=10）Tab.2 Renal histopathological score（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P Renal histopathological score 0.19±0.08 2.66±0.321）0.87±0.212）321.654 0.000

2.4 TNF-α、IL-4、IL-8水平模型组小鼠TNF-α、IL-4、IL-8表达高于对照组；温阳利水通络法组TNF-α、IL-4、IL-8表达低于模型组，见表3。

表3 TNF-α、IL-4、IL-8水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of TNF-α，IL-4 and IL-8（±s，n=10）

表3 TNF-α、IL-4、IL-8水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of TNF-α，IL-4 and IL-8（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P TNF-α/（ng·ml-1）0.21±0.14 1.35±0.181）0.51±0.122）161.758 0.000 IL-4/（ng·ml-1）0.19±0.08 1.12±0.361）0.38±0.132）48.231 0.000 IL-8/（ng·ml-1）0.32±0.17 1.55±0.311）0.56±0.212）73.779 0.000

2.5 肾组织相关蛋白表达模型组小鼠HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表达高于对照组；温阳利水通络法组HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表达低于模型组，见表4、图2。

图2 相关蛋白表达Fig.2 Expression of related proteins

表4 相关蛋白表达（±s，n=10）Tab.4 Related protein expression（±s，n=10）

表4 相关蛋白表达（±s，n=10）Tab.4 Related protein expression（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P HMGB1 0.11±0.05 0.71±0.151）0.34±0.112）75.436 0.000 LC3 0.19±0.11 0.82±0.281）0.40±0.132）28.288 0.000 Beclin-1 0.20±0.09 0.95±0.101）0.47±0.232）60.979 0.000

3 讨论

肾病综合征是表现为蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高脂血症的肾脏疾病的临床综合征，该病的发病原因多种多样，发病机制也不尽相同，涉及炎症反应、微循环障碍、代谢异常等多个方面［10-12］。现今的临床治疗以激素类药物为主，多数患者疗效不佳，并且一部分患者长期服用激素类药物还会产生较大的依赖性，一旦停止服药，病情就会加剧反弹［13］。肾脏相关的疾病大多与肾间质的损伤密切相关，其中肾脏损害、肾功能减退的主要表现是尿蛋白，同时也是肾病综合征的显著表现，并会导致肾小管间质损伤［14］。中医学将肾病综合症归属于“水肿”“虚劳”等范畴，其发病机制主要是肺、脾及肾脏功能失调，其本质是肾元亏虚，治疗原则当属疏风行水、运脾化湿、活血化瘀、利湿解毒等［15］。人体的水液代谢与肾、脾、肺的气化调节密不可分，气为阳，肾主水，水液代谢与肾阳的盛衰紧密相关，温阳利水通络法能够治疗脾肾阳虚型水肿，其临床疗效得到广泛肯定。研究表明，miR-141与HMGB1/Beclin-1间的平衡是影响肾病综合征发生发展的重要原因［8］。本文旨在研究温阳利水通络法调控HMGB1/Beclin-1信号通路对肾病综合征的治疗效果及作用机制。

自噬这一过程在机体内广泛进行，自体细胞或细胞部分被吞噬后被携裹至囊泡中，溶酶体与其结合为自噬溶酶体，满足细胞自体代谢及更新，保证内环境与细胞代谢互相制衡［16］。相关资料记载，miR-141能够与HMGB1结合，通过靶向抑制HMGB1的表达截断HMGB1/Beclin-1信号通路，减轻急性肾损伤诱导产生的肾病综合征，生理情况下的自噬并不会诱导肾病综合征的发生发展［15］。但患者体内出现炎症反应时，外周血中各种类型白细胞的比值会产生变化，严重时会导致免疫失衡［17］。相关资料表明，在TNF-α、IL-4、IL-8的调节控制下多个信号通路对炎症反应起作用［18-19］。本文通过实验对温阳利水通络法、肾病综合征及HMGB1/Beclin-1信号通路、TNF-α、IL-4、IL-8进行探索。留取小鼠静脉血以及尿液来检测小鼠肾功能指标发现，模型组小鼠CRE、BUN、24 h尿蛋白量水平明显高于对照组，证明造模后小鼠肾功能损伤，通过检测发现，模型组小鼠TNF-α、IL-4、IL-8水平升高，病理图也证实模型组小鼠肾组织出现损伤，肾小球肿大，肾小囊皱缩，边界不清晰，是明显的炎症反应，肾组织病理评分也出现异常升高，这提示小鼠模型建立成功，经过温阳利水通络法治疗后，小鼠肾功能指标水平下降，肾组织炎症反应得以缓解，肾小球肿胀缩小，肾小囊皱缩减弱，肾组织病理评分下降，TNF-α、IL-4、IL-8也下降，提示温阳利水通络法能够改善小鼠肾功能异常情况，缓解肾组织炎症反应，可通过调控肾病综合征大鼠的机体免疫改变，发挥抗炎作用。

Beclin-1是自噬基因［20］。HMGB1与细胞核内转录、复制、重组和基因组稳定性等密切相关，对于炎症、免疫反应、自噬及癌症也有调节控制作用［21］。相关研究指出，HMGB1可以诱导Beclin-1于Beclin-2中分离，并促进Beclin-1与Ⅲ型磷酸肌醇3激酶结合，激活自噬［22］。miR-141能够在HMGB1 mRNA的启动子上结合HMGB1受体从而阻断其表达，进而抑制HMGB1/Beclin-1通路阻断激发自噬体过程，但其在肾病综合征中是否也存在尚不可知［23］。实验发现，肾病综合征小鼠造模完成后，小鼠肾组织出现明显炎症变化，且蛋白表达上升，表明HMGB1/Beclin-1信号通路与肾病综合征密切相关，而经过温阳利水通络法治疗后，小鼠肾组织中HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表达下降，证明温阳利水通络法能够调控HMGB1/Beclin-1信号通路，对于肾病综合征中肾脏的损伤、炎症情况及临床症状都具有重要意义。

综上所述，温阳利水通络法能够调节控制HMGB1/Beclin-1信号通路作用于TNF-α、IL-4、IL-8水平，对于肾脏功能、肾脏损伤、炎症反应等也具备调节控制作用，同时指出miR-141可能与肾病综合征关系密切，需进一步深入讨论。