铂点缀的聚多巴胺纳米粒子的制备及其抗肿瘤性能研究

田 影，张爱清

(中南民族大学化学与材料科学学院，湖北 武汉 430074)

纳米材料用于肿瘤治疗在过去几十年获得了巨大的成功[1-3]。光热治疗(PTT)是一种很有潜力的肿瘤治疗方法，利用纳米材料吸收光能转化为热能，致使肿瘤细胞死亡，具有非侵袭性、高可控性等优点，备受研究者关注[4-6]。由于纳米材料在肿瘤中的富集是动态的，且合适的肿瘤治疗温度窗口较小，很容易造成光热治疗肿瘤部位温度过高，导致周围正常组织受损[7-8]。另外，光热治疗温度过高容易引起活性氧含量升高，导致炎症反应，甚至肿瘤转移。因此，清除光热治疗诱导的活性氧对肿瘤治疗的良好预后具有重大意义。

作者通过原位还原氯铂酸制备铂点缀的聚多巴胺纳米粒子(PDA/Pt NPs)，对其结构进行表征，并对PDA/Pt NPs的光热性能、抗氧化性能及抗肿瘤性能进行研究，为探究纳米材料用于肿瘤的光热治疗提供新的思路。

1 实验

1.1 材料与试剂

胎牛血清、1640培养基、MTT，Invitrogen公司。

氯铂酸、盐酸多巴胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2′,7′-二氯二氢荧光素双乙酸酯(DCFH-DA)、Calcein-AM、碘化吡啶(PI)，碧云天生物技术有限公司。

1.2 PDA纳米粒子(PDA NPs)的制备

PDA NPs通过经典的Stöber法制备。将60 mg Tris溶解于50 mL去离子水中，加入10 mL异丙醇，磁力搅拌15 min，混合均匀。将30 mg盐酸多巴胺用1 mL去离子水溶解，加入到Tris+异丙醇混合溶液中，继续搅拌24 h，离心洗涤,得到PDA NPs。

1.3 PDA/Pt纳米粒子(PDA/Pt NPs)的制备

配制2.5 mg·mL-1聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液30 mL，加入3 mg PDA NPs，磁力搅拌，混合均匀；继续加入0.3 mL 120 mmol·L-1氯铂酸溶液，80 ℃回流24 h，离心洗涤，得到PDA/Pt NPs。

1.4 PDA/Pt NPs的光热性能研究

配制不同浓度(50、100、200，μg·mL-1)的PDA NPs、PDA/Pt NPs水溶液，以去离子水为空白对照，在808 nm激光照射(1.5 W·cm-2，5 min)下，用热成像仪(FLIR ONE)监测溶液温度，每隔30 s记录溶液温度变化。

1.5 PDA/Pt NPs的抗氧化性能研究

用H2O2作为模式活性氧，用PDA/Pt NPs催化H2O2分解产生氧气，通过检测溶氧量变化研究PDA/Pt NPs的抗氧化性能。将30 mL浓度为200 μg·mL-1的PDA/Pt NPs水溶液加入50 mL试管中，加入10 mmol·L-1H2O2溶液，观察气泡产生情况，用溶氧仪检测溶氧量。

1.6 PDA/Pt NPs的体外抗肿瘤性能研究

首先，通过细胞活死染色法研究PDA/Pt NPs的细胞毒性。在6孔板中接种小鼠乳腺癌细胞(4T1)，培养24 h，加入浓度为100 μg·mL-1的PDA/Pt NPs水溶液，共培养4 h后，用808 nm激光照射(1.5 W·cm-2，8 min)；继续培养6 h，吸弃培养基，用Calcein-AM和PI染色，在倒置荧光显微镜下观察绿色和红色荧光。

其次，通过MTT法研究PDA/Pt NPs的细胞毒性。在96孔板中接种4T1细胞，培养24 h，加入不同浓度(0、12.5、25、50、100、200，μg·mL-1)的PDA/Pt NPs水溶液，共培养4 h后，用808 nm激光照射(1.5 W·cm-2，8 min)；继续培养24 h，加入MTT，继续培养4 h，吸弃培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜，用酶标仪检测572 nm处的紫外吸收。

1.7 PDA/Pt NPs的体内抗肿瘤性能研究

在BALB/c小鼠背部右腿跟处皮下注射100 μL约1×106个4T1细胞，构建小鼠皮下移植肿瘤模型。当肿瘤体积达到约100 mm3后，随机分成4组：PBS、PDA NPs+L(激光照射)、PDA/Pt NPs、PDA/Pt NPs+L，每组5只小鼠，通过尾静脉分别注射相应药物(1 mg·mL-1，200 μL)。注射药物1 h后，PDA NPs+L和PDA/Pt NPs+L组用808 nm激光照射(1.5 W·cm-2，8 min)肿瘤部位。每隔1 d测量肿瘤体积和小鼠体重。注射药物21 d后，处死小鼠，收集肿瘤组织，拍照，并用4%多聚甲醛固定，用于肿瘤组织切片和H & E染色。

2 结果与讨论

2.1 PDA/Pt NPs的结构表征

PDA/Pt NPs的扫描电子显微镜(SEM)照片、透射电子显微镜(TEM)照片及PDA NPs、PDA/Pt NPs的水合粒径见图1。

图1 PDA/Pt NPs的SEM照片(a)、TEM照片(b)和局部放大照片(c)及PDA NPs、PDA/Pt NPs的水合粒径(d)Fig.1 SEM image(a),TEM image(b),and locally amplified image(c) of PDA/Pt NPs,and hydrated particle size of PDA NPs and PDA/Pt NPs(d)

由图1a可知，PDA/Pt NPs为单分散的球形结构，平均直径约为150 nm，没有明显的结块。由图1b可知，PDA/Pt NPs由PDA NPs原位还原氯铂酸制备成功，Pt NPs点缀在PDA NPs上。由图1c可知，Pt NPs直径约为3 nm。通过动态光散射(DLS)检测，PDA NPs的平均水合粒径(Dh)约为161 nm，粒度分布(PDI)约为0.023；而PDA/Pt NPs的平均水合粒径约为200 nm(图1d)，纳米颗粒的粒度分布略有增加，表明制备的PDA NPs和PDA/Pt NPs粒径较为均匀。

PDA NPs和PDA/Pt NPs的Zeta电位和紫外吸收光谱见图2。

图2 PDA NPs和PDA/Pt NPs的Zeta电位(a)和紫外吸收光谱(b)Fig.2 Zeta potential(a) and UV absorption spectra(b) of PDA NPs and PDA/Pt NPs

由图2a可知，PDA NPs和PDA/Pt NPs显示出相似的负Zeta电位，因为PDA/Pt NPs表面仍有很多类似多酚的基团，这与PDA NPs的基团相似。由图2b可知，PDA NPs和PDA/Pt NPs有相似的紫外吸收光谱，在近红外光区808 nm处有较高的紫外吸收，表明PDA/Pt NPs具有光热效应的潜能。

2.2 PDA/Pt NPs的光热性能(图3)

图3 PDA NPs和PDA/Pt NPs的光热性能

由图3a可知，PDA NPs水溶液随着光照时间的延长温度快速上升，且随着PDA NPs水溶液浓度的增加，温度上升速度越快。PDA/Pt NPs水溶液也显示出与PDA NPs水溶液类似的光热效应(图3b)，表明PDA/Pt NPs水溶液的光热效应同样受其浓度和光照时间的影响。相比之下，空白对照组的温度在光照600 s后出现了约0.5 ℃的微弱升高。表明，PDA/Pt NPs可以快速有效地将808 nm近红外光能量转化为热能。

2.3 PDA/Pt NPs的抗氧化性能

PDA/Pt NPs催化H2O2分解产生氧气的结果见图4。

由图4a可知，PDA/Pt NPs可以迅速催化H2O2分解产生肉眼可见的气泡。利用溶氧仪检测到PDA/Pt NPs水溶液中确实产生了氧气，且溶氧量在2 min内迅速增加，2 min后，随光照时间的延长，溶氧量增加缓慢(图4b)。

(a)产生气泡照片 (b)溶氧量变化

2.4 PDA/Pt NPs的体外抗肿瘤性能(图5)

由图5a可知，当用PBS、PDA/Pt NPs处理4T1细胞时，有大量的绿色荧光(图中浅灰色区)出现，表明PBS或PDA/Pt NPs对细胞没有毒性。相比之下，当用PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L处理4T1细胞时，有大量的红色荧光(图中浅灰色区)出现，表明PDA NPs或PDA/Pt NPs在808 nm激光照射下能够杀死肿瘤细胞。由图5b可知，PBS和PDA/Pt NPs对4T1细胞没有明显的毒性；在808 nm激光照射下，随着PDA NPs和PDA/Pt NPs浓度的增加，对肿瘤细胞的毒性增强。表明，PDA/Pt NPs在808 nm激光照射下有较好的体外光热抗肿瘤效果。

图5 细胞活死染色法(a)和MTT法(b)研究PDA/Pt NPs的体外抗肿瘤性能Fig.5 In vitro antitumor property of PDA/Pt NPs determined by staining of live and dead cells(a) and MTT assay(b)

2.5 PDA/Pt NPs的体内抗肿瘤性能

小鼠的相对体重变化、肿瘤相对体积变化和实验结束后剥离出的肿瘤照片见图6。

图6 小鼠的相对体重变化(a)、肿瘤相对体积变化(b)和肿瘤照片(c)

由图6a可知，在实验期内，所有组中小鼠的体重均没有发生十分明显的变化。由6b可知，PBS、PDA/Pt NPs组的肿瘤体积随着时间延长快速增大，而PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L组的肿瘤体积前期略有增大，后期逐渐减小，表明在808 nm激光照射下，PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L组的肿瘤细胞生长明显受到了抑制，且在实验期间没有明显再增大。由图6c可知，PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L组的肿瘤体积明显减小，甚至有肿瘤完全消融。表明在808 nm激光照射下，PDA/Pt NPs具有较好的体内抗肿瘤性能。

肿瘤组织切片的H & E染色照片见图7。

图7 肿瘤组织切片的H & E染色照片

由图7可知，PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L组的肿瘤细胞明显破碎，显示出良好的光动力学治疗肿瘤效果。另外，PDA NPs+L组的H & E切片看到很多深色小点，这是发生了炎症反应，导致了免疫细胞在肿瘤处富集；而PDA/Pt NPs+L组的H & E切片只有少量的深色小点，说明没有发生严重的炎症反应，PDA/Pt NPs的抗氧化性能减少了过高热引起的炎症反应，有利于良好的肿瘤预后。表明，PDA/Pt NPs在近红外光照射下有良好的光动力学治疗肿瘤效果，且没有引发严重的炎症反应。

3 结论

通过原位还原氯铂酸制备铂点缀的聚多巴胺纳米粒子(PDA/Pt NPs)，PDA/Pt NPs为单分散的球形结构，直径约为150 nm，粒径均匀，具有光热性能和抗氧化性能。PDA/Pt NPs在808 nm激光照射下，对小鼠乳腺癌细胞(4T1)具有明显的抑制作用，实现了肿瘤的光热治疗，并减少了过高热引起的炎症反应，有利于良好的肿瘤预后。该研究巧妙地结合了PDA/Pt NPs的抗氧化和抗肿瘤性能，为纳米材料用于肿瘤的光热治疗提供了新的思路。