谷氨酸/N-琥珀酰化壳聚糖水凝胶的制备和性能

2023-01-18殷旭东蒋明星

化学与生物工程 2023年1期

殷旭东，蒋明星

(昆明学院农学与生命科学学院，云南昆明 650214)

高分子材料通过物理或化学交联的方式形成三维网络结构的水凝胶，水凝胶可以吸收和保存大量的水[1]。水凝胶的高分子主链或者侧链上存在着亲水和离子化的基团，从而具有类似生物体活性的特征[2]。水凝胶这种特殊的结构，使其在3D细胞培养和药物输送等医学领域有许多应用[3-4]。壳聚糖(CS)、透明质酸、海藻酸、纤维素、明胶等天然高分子材料[5-6]可以形成多种形式的水凝胶，并且具有良好的生物相容性和可降解性等显著特点[7-8]。其中，CS是自然界中带阳离子的多糖，具有良好的组织相容性和抑菌性能，广泛用于食品、医药等领域[9-10]。CS分子含有大量的氨基和羟基等亲水基团，很容易和其它分子形成水凝胶[11-12]。CS水凝胶在细胞培养方面显示了较好的应用价值[13]。但是，CS只在盐酸、乳酸、乙酸等无机或有机酸中溶解[14]，因此在制备CS水凝胶时，要先将CS溶解于酸性水溶液中，这样形成的CS水凝胶中含有酸性物质，不利于在组织工程中的应用。为了克服CS不溶于水的缺点，研究人员对CS进行了多种改性、共聚或者接枝，使得CS衍生物既保持了生物活性，又能够更方便地用于生物医学领域[15-16]。N-琥珀酰化壳聚糖(NSC)为CS的重要衍生物之一，其不仅具有良好的生物相容性，还可作为药物载体[17]。

谷氨酸(GA)为人体所必需的氨基酸，在食品工业中可用作调味剂，也经常用于细胞培养[18]，对于肿瘤细胞的分化具有抑制作用[19-20]。研究发现，GA可以和NSC形成GA/NSC水凝胶，可用作细胞培养支架和药物的输送载体。

作者在室温条件下，以一定质量的GA和NSC在水溶液中通过自组装制备GA/NSC水凝胶，表征GA/NSC水凝胶的结构，并研究GA/NSC水凝胶的主要性能和细胞毒性。

1 实验

1.1 试剂与仪器

壳聚糖(CS)，美仑生物技术有限公司；谷氨酸(GA)、琥珀酸酐、二甲基亚砜(DMSO)、氢氧化钠、无水乙醇，均为分析纯。

真空干燥箱，上海一恒仪器有限公司；FD1.0-60E型冷冻干燥机，丹麦Heto公司；EPUINOX55型红外光谱仪，德国Bruker公司；JSM-T300型扫描电镜，德国JEOL公司；PT-10型差示扫描量热仪(DSC)，德国Linseis公司；Bio-Rad多功能酶标仪，美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 NSC的制备

在磁力搅拌下，将2.0 g CS加入盛有40 mL DMSO的三口瓶中溶解；将4.0 g琥珀酸酐溶于20 mL DMSO中，并逐滴加入三口瓶中，65 ℃反应6 h；过滤去除溶剂，将反应物转入烧杯中，加入100 mL无水乙醇，室温下反应1 h；用40%NaOH溶液调节pH值至10～12，过滤；然后将反应物溶解于去离子水中，用无水乙醇反复沉淀；将白色沉淀在45 ℃下真空干燥。NSC的制备路线[21]如图1所示。

图1 NSC的制备路线Fig.1 Preparation route of NSC

1.2.2 GA/NSC水凝胶的制备

将1.5 g GA溶解于98.5 g去离子水中，配制成质量分数为1.5%的GA水溶液。将2 g NSC溶解于98 g去离子水中，配制成质量分数为2%的NSC水溶液。将20 mL NSC水溶液加入到100 mL小烧杯中，在磁力搅拌下，逐滴加入10 mL GA水溶液，静置5 min，形成GA/NSC水凝胶。

1.2.3 GA/NSC水凝胶的稳定性测试

取一定质量的GA/NSC水凝胶浸入去离子水中，在磁力搅拌下，分别逐滴加入0.1 mol·L-1NaOH溶液或0.1 mol·L-1盐酸溶液，测定pH值，观察水凝胶的变化。

1.2.4 GA/NSC水凝胶溶胀度的测定

称取一定量的真空干燥后的GA/NSC水凝胶(m1)置于烧杯中，加去离子水溶胀，每隔30 min取出，用滤纸吸去多余的水，称量GA/NSC水凝胶质量(m2)，按式(1)计算GA/NSC水凝胶的溶胀度(SR，%)：

(1)

1.2.5 CS、GA、NSC和GA/NSC水凝胶的红外光谱测试

分别将CS、GA、NSC和真空干燥后的GA/NSC水凝胶固体与溴化钾混合压片后，进行红外光谱测试。

1.2.6 GA/NSC水凝胶的DSC测试

将真空干燥的GA/NSC水凝胶5.6 mg置于坩埚内，在N2气氛下25～300 ℃范围内进行DSC测试，升温速率为10 ℃·min-1。

1.2.7 GA/NSC水凝胶的扫描电镜测试

将GA/NSC水凝胶经过-80 ℃冷冻干燥后，用扫描电镜观察其形貌特征。

1.2.8 GA/NSC水凝胶的体外细胞毒性检测

将L929细胞在含有5%青霉素-链霉素、10%胎牛血清蛋白的RPMI 1640灭菌培养液中培养，用细胞计数板计算L929细胞浓度后接种于96孔板中，细胞密度为每孔3 000 CFU，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h。将2%NSC水溶液和冻干GA/NSC水凝胶消毒灭菌处理后加入细胞板中，分别在细胞培养箱中培养24 h、48 h、72 h后，加入20 μL MTT溶液，再培养4 h，细胞生成蓝色的MTT结晶。加入0.15 mL DMSO，振荡溶解MTT结晶，用酶标仪测定490 nm处吸光度。设置空白组(细胞培养基)和阴性对照组(细胞培养基接种细胞)。按式(2)计算各组的细胞存活率(%)：

(2)

式中：ODexp、ODblank和ODnc分别为实验组、空白组和阴性对照组的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 GA/NSC水凝胶的形成机制(图2)

图2 GA/NSC水凝胶的形成机制Fig.2 Formation mechanism of GA/NSC hydrogels

2.2 GA/NSC水凝胶的稳定性(图3)

图3 冷冻干燥前(a)、后(b)的GA/NSC水凝胶照片Fig.3 Photos of GA/NSC hydrogels before(a) and after(b) freeze-drying

由图3可以看出，GA/NSC水凝胶呈半透明状，冻干的GA/NSC水凝胶呈白色有孔的泡沫状。GA/NSC水凝胶在去离子水中经过长时间的浸泡不会发生溶解。向GA/NSC水凝胶中逐滴加入0.1 mol·L-1NaOH溶液，在pH>8.7时，GA/NSC水凝胶会逐渐溶解；向GA/NSC水凝胶中逐滴加入0.1 mol·L-1盐酸溶液，在pH<4.2时，GA/NSC水凝胶亦会逐渐溶解。表明，GA/NSC水凝胶对酸碱敏感，为pH响应的水凝胶。

2.3 GA/NSC水凝胶的溶胀性能

GA/NSC水凝胶的溶胀度随时间的变化曲线如图4所示。

图4 GA/NSC水凝胶的溶胀曲线Fig.4 Swelling curve of GA/NSC hydrogels

由图4可以看出，随着时间的延长，GA/NSC水凝胶的溶胀度逐渐增大，当时间达到3.5 h时，溶胀度为614%，之后溶胀度趋于稳定。表明，GA/NSC水凝胶有较好的溶胀性能。

2.4 GA/NSC水凝胶的红外光谱(图5)

图5 CS、GA、NSC、GA/NSC水凝胶的红外光谱Fig.5 IR spectra of CS，GA，NSC，and GA/NSC hydrogels

由图5可以看出，CS的红外光谱在3 300～3 500 cm-1处，出现-OH伸缩振动和-NH2伸缩振动重叠峰；在1 155 cm-1和1 092 cm-1处分别出现一次-OH和二次-OH的伸缩振动吸收峰；在2 876 cm-1处出现C-H伸缩振动吸收峰。由于CS分子中含有一定量的乙酰氨基，所以CS有酰氨基的3个特征吸收峰，分别在1 596 cm-1处(酰胺-Ⅰ谱带)、1 424 cm-1处(酰胺-Ⅱ谱带)和1 381 cm-1处(酰胺-Ⅲ谱带)。与CS相比，在NSC的红外光谱中，在1 638 cm-1处出现仲酰胺C=O伸缩振动吸收峰，说明CS分子的-NH2发生反应；在1 547 cm-1处出现COO-反对称伸缩振动强吸收峰，说明NSC分子引入了羧基；在1 064 cm-1和1 026 cm-1处出现-OH伸缩振动吸收峰，没有明显变化，表明，CS的-OH没有发生反应。