丹参总黄酮提取工艺的优化及其抑菌活性研究

龙 旭，王蕾萌，龚 莉，雷亚婷，郭 惠，靳如意

(陕西中医药大学 陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心，陕西 咸阳 712046)

丹参为唇形科(Labiatae)鼠尾草属(SalviamiltiorrhizaBunge.)植物的根茎，因根茎颜色多为红色且形似参类而得名[1-2]。丹参味苦，性微寒，归心经、肝经，具有祛瘀止痛、舒筋活血、清心避暑、抗菌消炎、凉血消痈等功效[1-6]，可用于治疗月经不调、经闭痛经、热痹疼痛、冠心病、高血压、心绞痛、心肌缺血、肝硬化、肿瘤等症[4-8]。丹参中的丹参素、丹酚酸、丹酚酸甲酯、迷迭香酸、咖啡酸等为水溶性成分，具有改善微循环、抗血栓等作用[5]。丹参中以松香烷型二萜类化合物为主的成分，如丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、丹参酮Ⅵ、异丹参酮、隐丹参酮等为脂溶性成分，具有抗癌、保护心脏和神经的作用[5-8]。基于丹参黄酮类物质广泛的药理活性，其相关药物研发成为研究热点。

黄酮类物质传统的提取工艺主要包括浸渍法、渗漉法、水煮法、有机溶剂回流提取法等，但普遍存在杂质含量高、提取率低、提取时间长、溶剂消耗量大等缺点。超声提取法利用超声波辐射产生强烈的空化效应、机械振动、扰动效应和搅拌等多种作用，加快物质分子振动的频率和速度，提高溶剂的穿透力，从而击破植物细胞壁，高效、快速地提取细胞内容物[9]。与传统的水煮法及有机溶剂回流提取法相比，超声提取法具有速度快、提取率高、适用范围广、不破坏中药材活性成分的化学结构等特点。丹参总黄酮可破坏细菌DNA致其死亡，尤其对革兰氏菌的抑制效果显著，可开发为天然防腐剂[10]。在此，作者通过单因素实验对超声提取法和热回流提取法提取丹参总黄酮进行比较研究，再通过响应面法进一步优化丹参总黄酮的提取工艺，并研究丹参总黄酮对革兰氏菌的抑制活性，为陕西省道地药材丹参的高效提取及深入开发奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

丹参(根茎)，西安药材市场。

硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇，均为分析纯；芦丁标准品(HPLC 纯度98%)；二次水，自制。

TP-A200型电子天平，福州华志科学仪器有限公司；FSJ-A03D1型粉碎机，广东小熊电器有限公司；HJ-3A型磁力搅拌器，常州丹瑞实验仪器设备有限公司；SHB-Ⅲ型真空泵，西安大康生物科技有限公司；DHG-9030型干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；UV1102型紫外可见分光光度计，上海天美科技仪器有限公司；KQ-400KDE型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；RE-200A型旋转蒸发仪，西安予辉仪器有限公司。

1.2 芦丁标准曲线的绘制

参照文献[11]配制系列浓度的芦丁标准溶液，于最大吸收波长510 nm处分别测定其吸光度，以浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线(图1)，拟合得到线性回归方程为：A=0.0011+9.42286c，R2=0.99996。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.3 丹参总黄酮的提取

将丹参于50 ℃干燥5 h，自然冷却后，粉碎，过80目筛，得到丹参细粉，于密封袋保存，备用。精确称取5.0 g丹参细粉于回流瓶中，按料液比1∶10(g∶mL，下同)加入50 mL一定体积分数的乙醇，65 ℃超声提取50 min或回流提取120 min，抽滤；残渣重复提取2次，合并滤液，旋转蒸发，萃取，定容后，测定510 nm处吸光度。按下式计算丹参总黄酮提取率(mg·g-1)：

式中：c为经标准曲线方程计算得到的提取液中总黄酮浓度，mg·mL-1；V为提取液体积，mL；m为丹参细粉质量，g。

1.4 丹参总黄酮的抑菌活性评价

1.4.1 菌悬液的制备

将一定量的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌接种至灭菌的培养基中，(36±1) ℃培养24 h，再用灭菌生理盐水稀释至103～105CFU·mL-1。

1.4.2 抑菌圈直径的测定

采用滤纸片浸渍法测定抑菌圈直径。将0.5 cm定性滤纸圆片置于离心管中，高压灭菌后，干燥，备用。以灭菌生理盐水稀释丹参总黄酮提取浓缩液，分别配成梯度浓度1 mg·mL-1、5 mg·mL-1、10 mg·mL-1和20 mg·mL-1的丹参总黄酮溶液，过滤除菌后，加入含0.5 cm定性滤纸圆片的离心管中，浸泡30 min；超净工作台上，将灭菌培养基倒入培养皿中，紫外灭菌冷却后，加入103～105CFU·mL-1菌悬液20 μL，涂布均匀；用无菌镊子夹取浸有丹参总黄酮溶液的滤纸圆片，略干后放入培养皿中；将培养皿于36 ℃培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径，平行测定3次，结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1 丹参总黄酮提取工艺的优化

2.1.1 单因素实验结果

2.1.1.1 料液比对丹参总黄酮提取率的影响(图2)

图2 料液比对丹参总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

从图2可知，超声提取法的丹参总黄酮提取率高于热回流提取法，且超声提取法的总黄酮提取率受料液比的影响较小。随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，两种方法的总黄酮提取率均呈先升高后降低的趋势，当料液比为1∶10时，总黄酮提取率最高。这是由于，溶剂乙醇用量增加，其与丹参细粉有效接触的比表面积增大，促使黄酮类有效成分扩散并转移至溶剂中，提取率快速提高；但溶剂用量过大时，溶质占比减小，黄酮类有效成分在溶剂中的比例降低，后处理过程中总黄酮损失增大，导致总黄酮提取率降低。

2.1.1.2 提取时间对丹参总黄酮提取率的影响(图3)

图3 提取时间对丹参总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

从图3可知，基于热效应、空化效应和机械效应，超声提取法所耗时间较短、丹参总黄酮提取率略高。随着提取时间的延长，两种方法的总黄酮提取率均呈先升高后降低的趋势，且超声提取法的总黄酮提取率下降趋势比热回流提取法的缓慢。当提取时间为30 min时，超声提取法的总黄酮提取率达到最高；当提取时间为90 min时，热回流提取法的总黄酮提取率达到最高。这是由于，溶剂与丹参细粉接触时间延长促使溶剂充分浸润丹参细粉，溶解至溶剂中的黄酮类有效成分增加，总黄酮提取率升高；但提取时间过长，总黄酮中的热敏组分在高温下会发生分解，导致总黄酮提取率下降。

2.1.1.3 提取温度对丹参总黄酮提取率的影响(图4)

图4 提取温度对丹参总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

丹参中的丹参酮ⅡA、丹酚酸B等物质含有醌类结构，在高温下会发生氧化、聚合等反应，加热温度过高或时间过长会导致有效成分被破坏，因此，提取温度对丹参总黄酮提取率的影响较大。从图4可知，随着提取温度的升高，两种方法的总黄酮提取率均呈先升高后降低的趋势，且相同提取温度下，超声提取法的总黄酮提取率高于热回流提取法的。当提取温度为65 ℃时，超声提取法的总黄酮提取率达到最高；当提取温度为75 ℃时，热回流提取法的总黄酮提取率达到最高。这是由于，超声波的空化作用和机械作用大大提高了溶剂与溶质的摩擦力和剪应力，促进有效物质快速溶解，而提取温度过高，溶剂与溶质间的热效应会导致总黄酮中的热敏组分发生分解，使总黄酮提取率下降。

2.1.1.4 乙醇体积分数对丹参总黄酮提取率的影响(图5)

从图5可知，随着乙醇体积分数的增大，两种方法的丹参总黄酮提取率的变化趋势基本一致，均呈先升高后略下降的趋势，且超声提取法的总黄酮提取率略高于热回流提取法的。当乙醇体积分数为85%时，超声提取法与热回流提取法的总黄酮提取率均达到最高，分别为4.12 mg·g-1、3.82 mg·g-1；但继续增大乙醇体积分数，总黄酮提取率反而下降。这是由于，丹参有效成分分为水溶性成分和脂溶性成分，若乙醇体积分数过低，脂溶性成分不能被充分溶解；而乙醇体积分数过高，水溶性成分溶解性降低，导致总黄酮提取率下降。

图5 乙醇体积分数对丹参总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

2.1.2 响应面实验结果

2.1.2.1 响应面实验设计及结果

对比两种提取方法的单因素实验结果，超声提取法总体优于热回流提取法。以丹参总黄酮提取率为响应值，以料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、乙醇体积分数(D)为自变量，设计4因素3水平响应面实验，进一步优化丹参总黄酮的超声提取工艺。响应面实验的因素与水平如表1所示，设计及结果如表2所示。

表1 响应面实验的因素与水平

表2 响应面实验设计及结果

采用Design-Expert软件对表2数据进行拟合，得到二次回归方程：Y=4.14+0.0175A-0.0167B+0.0933C+0.0258D-0.0575AC+0.0500AD+0.0550BC-0.0550BD+0.0275CD-0.1779A2-0.1792B2-0.1767C2-0.1829D2，R2=0.9945。

回归模型的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

从表3可知，模型P<0.0001，说明回归模型高度显著，模型拟合度高，实验误差较小。一次项B、交互项CD对丹参总黄酮提取率的影响显著；一次项A的影响极显著；一次项C、D，交互项AC、AD、BC、BD，二次项A2、B2、C2、D2的影响高度显著。由F值可知，各因素对丹参总黄酮提取率影响的大小顺序为：提取温度(C)>乙醇体积分数(D)>料液比(A)>提取时间(B)。

2.1.2.2 最佳工艺的确定及验证

通过Design-Expert软件对二次回归方程求一阶导，得到最佳超声提取工艺如下：料液比1∶10、提取时间22 min、提取温度68 ℃、乙醇体积分数86%，丹参总黄酮提取率理论值为4.151 mg·g-1。在此条件下进行3次平行验证实验，总黄酮平均提取率为4.140 mg·g-1，相对平均偏差为0.10%，RSD值为0.14%，与理论值接近。

2.2 丹参总黄酮的抑菌活性

植物源黄酮可破坏细菌细胞壁膜的完整性及通透性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有一定的抑制效果。通过测定抑菌圈直径，考察不同浓度丹参总黄酮的抑菌活性，结果如表4所示。

表4 不同浓度丹参总黄酮的抑菌活性

从表4可知，丹参总黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌有明显的抑制作用，且随着浓度的增加，丹参总黄酮的抑菌作用越强。在相同浓度下，丹参总黄酮对革兰氏菌的抑制作用大小为：大肠埃希菌>金黄色葡萄球菌>铜绿假单胞菌。因此，丹参总黄酮可作为天然抗菌剂进一步开发。

3 结论

通过单因素实验对超声提取法和热回流提取法提取丹参总黄酮进行了比较研究，发现超声提取法优于热回流提取法，再通过响应面法进一步优化丹参总黄酮的超声提取工艺，确定最佳超声提取工艺为：料液比1∶10(g∶mL)、提取时间22 min、提取温度68 ℃、乙醇体积分数86%，在此条件下，丹参总黄酮提取率为4.140 mg·g-1，与理论值(4.151 mg·g-1)接近。抑菌实验结果表明，丹参总黄酮对革兰氏菌的抑制作用大小为：大肠埃希菌>金黄色葡萄球菌>铜绿假单胞菌。