星点设计-效应面法优化瑞德西韦/羟丙基-β-环糊精包合物的制备工艺

刘 洋，闵 婕，顾 念，陆 洁，章晓骅，徐 丹

(南京正大天晴制药有限公司 制剂所，江苏 南京 210046)

冠状病毒是自然界广泛存在的一大类病毒，属于套式病毒目冠状病毒科，某些冠状病毒会感染人类并引起疾病，如严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征等。2019冠状病毒疾病(COVID-19)[1]是目前已知的第7种可感染人的冠状病毒，全球范围内已引起数千万人感染，数百万人死亡[2]，成为严重威胁人类生命健康的公共卫生事件。

瑞德西韦(Remdesivir)可通过竞争性抑制核苷类RNA依赖的RNA聚合酶抑制病毒感染[3]，适应性新型冠状病毒肺炎治疗试验(ACTT-1)证实瑞德西韦是治疗2019冠状病毒疾病的有效药物之一[4]，但瑞德西韦的水溶性低(水中的溶解度小于0.03 mg/mL)、稳定性差等特点，限制了其制剂制备和临床使用。β-环糊精包合技术是难溶性药物注射给药增溶技术之一，通过将药物分子全部或部分包入环糊精形成的空穴中，具有提高难溶性药物溶解度、提高药物稳定性和生物利用度等优点[5-6]；羟丙基-β-环糊精是一种理想的包合物制备辅料，具有较好的溶解度和较低的毒性[7]，已用于多个市售包合物制剂中。

星点设计是在析因设计基础上加上星点及中心点的试验设计方法，具有试验次数少、试验精度高等优点，在制剂处方或工艺优化中应用广泛[8]。星点设计-效应面优化法通过描绘效应对考察因素的效应面，并从效应面上选择较佳的效应区，从而得到最佳实验条件；由于效应与因素间的关系可能是线性或非线性，即效应面对应为平面或曲面，因此，可通过建立效应与因素间的数学模型来描绘效应面函数，并通过复合相关系数(r)来评价数学模型与效应面函数的近似程度，复合相关系数(r)越高表明预测值更接近真实值，效应面的近似程度和优选条件的准确度越高[9]。

本研究采用星点设计-效应面法优化瑞德西韦包合物的制备工艺，并对包合物进行鉴别，为我公司后续产品开发和生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

SQP SECURA313-1CN型电子天平，德国赛多利斯公司；RET B S25型磁力搅拌器，德国IKA公司；S210-K型酸度计，瑞士Mettler Toledo公司；HWS26型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；LYO-0.5型冷冻干燥机，上海东富龙科技股份有限公司；e02695型高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.2 主要材料

瑞德西韦(批号：AEMD-200302)，南京正大天晴制药有限公司；HP-β-CD(批号：47K180519)，匈牙利Cylolab公司；盐酸、NaOH(分析纯)，南京化学试剂股份有限公司；乙酸(分析纯)，美国ROE Scientific Inc.；乙腈(色谱纯)，美国TEDIA公司。

1.3 方法

1.3.1 包合物的制备

精密称取规定量的瑞德西韦和HP-β-CD，将HP-β-CD溶于50 mL纯化水中，采用稀盐酸(浓度为1 mol/L)调节溶液pH至目标值，加入瑞德西韦，在一定温度下磁力搅拌60 min进行包合，0.22 μm滤膜过滤，0.5 mol/L NaOH调pH至3.5，定容至50 mL，搅拌混匀后，冷冻干燥即得。

1.3.2 HPLC法测定包合物中瑞德西韦

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)，流动相为0.1%乙酸水溶液-乙腈(体积比为55∶ 45)。精密称取瑞德西韦10 mg，乙腈溶解并定容至20 mL，摇匀。20%乙腈稀释成的药物质量浓度分别为28、32、36、40、44和48 μg/mL系列标准溶液。取标准溶液10 μL注入高效液相色谱仪，柱温为35 ℃，检测波长为243 nm，流速为1.0 mL/min。理论塔板数(按瑞德西韦计算)不低于2 000，分离度大于1.5。记录峰面积A，以瑞德西韦的质量浓度ρ为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3 考察指标

包合率(Y1)是包合物的重要指标，精密称取瑞德西韦/HP-β-CD包合物100 mg于50 mL量瓶中，乙腈溶解定容后，精密量取1 mL溶解后的溶液于50 mL容量瓶中，20%乙腈定容，得解包合后的瑞德西韦/HP-β-CD供试液，进样10 μL，记录色谱图及峰面积，代入标准曲线，计算得包合瑞德西韦质量(W包)。按式(1)计算瑞德西韦/HP-β-CD包合物的包合率，而包合工艺筛选的重要指标的收率(Y2)的计算见式(2)。

Y1=W包/W总×100%

(1)

Y2=m(干燥包合物)/(m(HP-β-CD)+
m(瑞德西韦) )

(2)

本研究中，Y1和Y2均取值越大越好，因此采用Hassan[6]方法。dn=(Ymax-Yn)/(Ymax-Ymin)将各指标转换成“归一值”，并计算几何平均数，得总评“归一值OD”，OD=(d1d2···dn)1/n，其中n为指标数，d为各指标“归一值”[7]。

1.3.4 星点设计-效应面法优化工艺

1)因素水平的确定。影响Y1、Y2和OD的主要因素包括HP-β-CD/瑞德西韦摩尔比、包合温度、溶液pH和包合时间等。通过预实验发现，当包合时间超过5 min时，其波动大小导致考察指标的变化基本保持在±5%以内，因此，包合时间不纳入本研究参数考量范围，仅从HP-β-CD/瑞德西韦摩尔比、包合温度、溶液pH这3个因素进行优化。采用单因素试验，固定其中2个因素，考察第3个因素对Y1、Y2和OD的影响，以确定各因素的取值水平。

2)星点设计方案。以单因素试验结果为依据，采用星点设计优化包合工艺[8-9]。根据星点设计原理，每个因素设5个水平，分别用代码值-α、-1、0、1、α表示(三因素星点设计α=1.682)。

3)模型拟合和方差分析。以包合率(Y1)、收率(Y2)和几何总评“归一值OD”作为因变量，HP-β-CD/瑞德西韦摩尔比(X1)、包合温度(X2)和溶液pH(X3)为自变量，应用Design Expert 8.0软件进行多元线性回归和多项式方程拟合，采用复相关系数(r)对模型好坏进行评价。采用ANOVA分析效应面的回归参数。

4)效应面优化设计。采用Design Expert 8.0软件分析，绘制几何总评“归一值OD”与影响显著的2个自变量的三维效应面和二维等高图(另外1个自变量设为中心点值)，预测最佳包合条件。

1.3.5 最优处方工艺验证

按最佳包合条件重复试验3次，预测值与实测值的偏差的计算见式(3)。

偏差=(预测值-实测值)/预测值×100%

(3)

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

通过试验绘制瑞德西韦线性回归曲线，回归方程为A=33 817ρ-27 018(r2=0.999 7)，表明在28～48 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2 因素水平的确定

考察HP-β-CD /瑞德西韦的摩尔比、包合温度和溶液pH等单因素预实验，结果见表1～表3。由表1～3可知：当HP-β-CD/瑞德西韦的摩尔比为8∶1时，Y1和Y2值最大，此后随着摩尔比增大，Y1和Y2值基本趋于稳定，因此选定HP-β-CD/瑞德西韦摩尔比为8∶1作为中心点。当包合温度为27.5 ℃时，Y1和Y2值最大，此后随着包合温度升高，Y1和Y2值基本趋于稳定，因此选定27.5 ℃作为中心点。当溶液pH为1.8时，Y1和Y2值最大，此后随着pH降低，Y1和Y2值趋于稳定，因此选定pH 1.8作为中心点。

表1 HP-β-CD/瑞德西韦摩尔比对包合效果的影响

表2 包合温度对包合效果的影响

表3 溶液pH对包合效果的影响

2.3 星点设计试验结果

在单因素实验结果的基础，设计包合物工艺优化星点设计的试验，具体设计及结果见表4，并进行模型拟合及方差分析，结果见表5。

根据表4的结果，分别采用多元线性回归、二次多项式、三次多项式对试验结果进行拟合，具体拟合的结果见式(1)～(3)。

表4 瑞德西韦/HP-β-CD包合物工艺优化星点设计及结果

表5 拟合方程方差分析结果

多元线性回归方程：Y1=85.73+5.70X1+3.99X2+1.42X3(r=0.759，P=0.000 7)；Y2=88.00+11.54X1+1.22X2+1.91X3(r=0.763，P=0.000 6)；OD=0.71+0.25X1+0.11X2+0.047X3(r=0.772，P=0.000 5)。

(1)

(2)

(3)

由式(1)～(3)可知：二项式拟合方程的复合相关系数(r)最大且接近1，表明二项式拟合较多元线性回归拟合度高、预测性好，故选择二项式拟合为最佳模型。

2.4 效应面优化试验结果

在星点设计试验的基础上，进行效应面优化，各自变量间的三维效应曲面图见图2～4。由图2～4可知：预测得瑞德西韦/HP-β-CD包合物制备的最佳包合条件：HP-β-CD/瑞德西韦的摩尔比为8.0，包合温度为27.5 ℃，溶液pH为1.8。预测的包合率和收率分别为94.27%、96.23%。

图2 HP-β-CD/瑞德西韦的摩尔比值与包合温度对OD值的影响Fig.2 Effects of HP-β-CD/Remdesivir molar ratio and inclusion temperature on the OD value

图3 HP-β-CD/瑞德西韦的摩尔比值与溶液pH对OD的影响Fig.3 Effects of HP-β-CD/Remdesivir molar ratio and solution pH on OD value

图4 包合温度与溶液pH对OD的影响Fig.4 Effects of inclusion temperature and solution pH on OD value

2.6 最优处方工艺验证结果

基于以上的优化试验结果，按最佳包合条件进行平行3组包合验证试验，结果见表6。由表6可知：包合率的预测值与实测值之间偏差为2.11%，收率的预测值与实测值之间偏差为2.33%，偏差均很小，表明拟合方程可以较好地描述各因素与评价指标的关系。

表6 包合验证试验结果

3 结论

选用羟丙基-β-环糊精作为包合物材料，采用星点设计-效应面法优化瑞德西韦/HP-β-CD包合物处方工艺，与线性回归方程和三项式拟合方程相比，二项式拟合方程的拟合度更好，通过描绘三维效应面和二维等高图，确定了较优的制备工艺是HP-β-CD/瑞德西韦的摩尔比值为8.0、包合温度为27.5 ℃、溶液pH为1.8，按照预测的最优工艺制备的包合物的包封率和收率与预测值偏差均<5%，表明二项式拟合方程能较好地描述各因素与评价指标的关系。

综上，采用星点设计-效应面法优化得到的瑞德西韦/HP-β-CD包合物最优处方工艺可靠且重现性好，为后续包合物品种的开发及工业化生产提供参考。