多变量统计分析评价清胃散配方颗粒与标准汤剂主要物质基础的一致性

张 倩，张天南，刘欢欢,2，刘史佳，张先林，杨 静，姚 毅

(1.南京中医药大学附属医院 药学部，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210038)

经典名方清胃散源于金代李东垣的《兰室秘藏》和《脾胃论》，是常用清热剂，主治胃火牙痛之证，在临床上被广泛使用[1]，现作为重点研究的经方之一被收录在2018年国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》中[2]。目前，关于清胃散的研究多见文献考证及临床应用报道，近两年有研究报道清胃散水煎液的特征图谱、煎煮工艺和物质基准的量值传递[2-4]，但尚未见清胃散配方颗粒的相关研究。

中药配方颗粒是在中医药理论指导下，依据质量标准，采用现代科技手段将中药饮片提取、浓缩、干燥、制粒，并定量分装成统一的规格和剂量，供临床调剂使用，具有质量稳定、方便调剂、剂量准确、卫生以及贮存携带方便等特点[5]。但是，中药配方颗粒与传统饮片汤剂的主要物质基础及溶出程度是否相同，药效和安全性是否等效，目前仍缺乏公认可行的一致性评价方式和标准[6-7]。标准汤剂是按照临床汤剂煎煮流程的规范化操作，固液分离，经适当浓缩的方法干燥制得[5]，具备临床中药汤剂的物质基准。清胃散配方颗粒市场应用前景广泛，因此有必要开展其配方颗粒与标准汤剂主要物质基础的一致性评价研究，为其临床的合理化应用提供参考。

本研究拟制备15批清胃散标准汤剂，建立高效液相色谱(HPLC)特征指纹图谱及指标性成分含量测定的分析方法，以HPLC特征指纹图谱相似度，以及指标性成分(没食子酸、芍药苷、阿魏酸、异阿魏酸、表小檗碱、升麻素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及丹皮酚)的质量分数为指标，运用多变量统计分析方法，评价清胃散配方颗粒与标准汤剂化学成分的一致性，以期为后续评价生物效应的一致性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Agilent1260型高效液相色谱仪(配G1322A脱气机、G1312B二元泵、G1367E自动进样仪、G1316D柱温箱和G4212B二极管阵列检测器)，美国Agilent公司；AX224ZH/E型电子天平，常州市奥豪斯仪器有限公司；KQ-1000型医用超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HH-601型超级电热恒温水浴箱，金坛市环宇科学仪器厂；80-2型台式低速离心机，常州市国华电器有限公司；Eppendorf 5430R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

对照品盐酸小檗碱(批号：Y31J9H67024、纯度≥98%)，丹皮酚(批号：D1619066、纯度≥98%)，阿魏酸(批号：H27J7L16718、纯度≥98%)，异阿魏酸(批号：A11M9L61182、纯度≥98%)，没食子酸(批号：C13O9C72105、纯度≥98%)，盐酸巴马汀(批号：Z16J10X79792、纯度≥98%)，升麻素(批号：Y11O9H72162、纯度≥98%)，上海市源叶生物科技有限公司；表小檗碱(批号：C10743482、纯度≥98%)，上海市麦克林生物科技有限公司；芍药苷(批号：lw19010908、纯度≥98%)，南京市良玮生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，德国Merck公司；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。

不同批次的中药材由安徽万生中药饮片有限公司、安徽马鞍山井泉中药饮片有限公司、安徽协和成中药饮片有限公司、贵州同德中药饮片有限公司帮助，从道地产区收集并加工成饮片，其中黄连11批、牡丹皮15批、升麻13批、当归14批、生地黄12批，经南京中医药大学附属医院朱育凤主任中药师鉴定为毛茛科黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎，毛茛科牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，毛茛科大三叶升麻CimicifugaheracleifoliaKom.的干燥根茎，伞形科当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根和玄参科地黄的RehmanniaglutinosaLibosch.干燥块根。随机组成15批清胃散标准汤剂样品，详细信息见表1。

表1 清胃散标准汤剂中药饮片信息

1.2 方法

1.2.1 标准汤剂的制备

饮片随机组合后打粉，按照文献[4]的煎煮工艺条件，取处方量饮片粗粉共24 g至锅中，加288 mL水，浸泡30 min后，大火煮沸后再小火煎煮60 min，重复煎煮2次，浓缩至200 mL，过滤即得。取适量标准汤剂，混匀后以4 000 r/min离心3 min，移取上清液过0.45 μm滤膜，取过滤液，即得供试品溶液。

1.2.2 配方颗粒溶液的制备

取换算后处方量的中药配方颗粒共12.8 g至锅中，加200 mL热水溶解，过滤即得中药配方颗粒溶液。取适量中药配方颗粒溶液，混匀后以4 000 r/min离心3 min，移取上清液过0.45 μm滤膜，取过滤液，即得供试品溶液。

1.2.3 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、芍药苷、阿魏酸、异阿魏酸、表小檗碱、升麻素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和丹皮酚对照品适量，用甲醇溶解后定容，即得各对照品母液。

精密移取各对照品母液一定量，混合后，用体积分数30%甲醇水溶液定容至同一容量瓶内，配制成已知质量浓度的混合对照品溶液(含没食子酸333.33 μg/mL、芍药苷444.44 μg/mL、阿魏酸333.33 μg/mL、异阿魏酸444.44 μg/mL、表小檗碱333.33 μg/mL、升麻素55.56 μg/mL、盐酸小檗碱333.33 μg/mL、盐酸巴马汀333.33 μg/mL及丹皮酚222.22 μg/mL)，置于4 ℃冰箱内保存。

1.2.4 HPLC特征指纹图谱

色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：磷酸二氢铵缓冲液(A)，pH=3；甲醇(B)，梯度洗脱如下：0～15 min，1%(体积分数，下同) B ；15～20 min，1%～10% B；20～30 min，10%～14% B；30～40 min，14%～15% B；40～55 min，15%～22% B；55～65 min，22%～30% B；65～90 min，30%～40% B；90～100 min，40%～70% B；100～110 min，70% B；110～120 min，70%～1% B；120～125 min，1% B；流速1 mL/min；检测波长230 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。取对照品溶液、标准品汤剂和配方颗粒溶液进样分析，记录峰面积。

1.2.5 清胃散主要物质基础的含量测定

1.2.5.1 样品溶液和对照品溶液的制备

同1.2.1、1.2.2和1.2.3项中的方法，制备样品和对照品溶液。

1.2.5.2 单味药溶液的制备

随机选择黄连、牡丹皮、升麻、当归和地黄饮片，按处方量分别称取每味药，按1.2.1项中方法制备黄连、牡丹皮、升麻、当归和地黄的5份单味药供试品溶液。

1.2.5.3 方法学的考察

1)专属性和线性关系。按照文献[4]的方法，精密吸取上述1.2.3项中混合对照品溶液适量，用体积分数30%甲醇水溶液稀释混合均匀后，倍比稀释得到系列质量浓度的混合对照品溶液。按1.2.4项中色谱条件进样分析，以对照品质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，线性回归得到主要物质基础的回归方程、相关系数及线性范围。

2)精密度。按1.2.1项中方法，制备标准汤剂10 μL，按1.2.4中色谱条件连续进样6次，以峰面积计算相对标准偏差(RSD)。

3)重复性。按1.2.1项中方法，平行制备6份标准汤剂，按1.2.4项中色谱条件进样分析，以峰面积计算RSD。

4)稳定性。取同一标准汤剂6份，于室温25 ℃放置，分别于 0、6、12、24、36 h精密吸取10 μL，按1.2.4项中色谱条件进样分析并记录峰面积；再取同一标准汤剂6份存放于4 ℃冰箱，分别测定0、3、5和7 d的各成分峰面积，以峰面积计算RSD。

5)加样回收率。分别精密吸取平行制备的已测定浓度的6份标准品汤剂，每份100 μL，分别精密添加相当于已知含没食子酸、芍药苷、阿魏酸、异阿魏酸、表小檗碱、升麻素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及丹皮酚的混合对照品适量，按1.2.4项中色谱条件进样分析，记录峰面积并计算各成分的加样回收率。

6)主要物质基础的含量测定。取对照品溶液、标准汤剂、配方颗粒溶液和单味药溶液，按1.2.4项中色谱条件进样分析，记录保留时间和峰面积。

2 结果与分析

2.1 HPLC特征图谱的分析结果

按照1.2.1和1.2.2项中所述制备标准汤剂和配方颗粒溶液的方法，并按照1.2.4项中色谱的条件进样，记录色谱图。按照文献[4]的方法，采用对照品比对，共确定了30个共有峰(图1)，由图1可知：9个共有峰分别为没食子酸(5号峰)、芍药苷(16号峰)、阿魏酸(18号峰)、异阿魏酸(19号峰)、表小檗碱(21号峰)、升麻素(22号峰)、盐酸小檗碱(25号峰)、盐酸巴马汀(26号峰)和丹皮酚(29号峰)。黄连的特征峰分别为2、14、15、20、21、22、23、25和26号峰，其中第21号峰为表小檗碱，第25号峰为盐酸小檗碱，第26号峰为盐酸巴马汀；升麻的特征峰分别为3、4、6、7、12、13、18、19、24、27和28号峰，其中第18号峰为阿魏酸，第19号峰为异阿魏酸，第22号峰为升麻素；牡丹皮的特征峰分别为5、8、10、11、16、17、29和30号峰，其中第5号峰为没食子酸，第16号峰为芍药苷，第29号峰为丹皮酚；当归的特征峰分别为9和18号峰，其中第18号峰为阿魏酸。

图1 清胃散标准汤剂、配方颗粒和单味药及各指标性成分对照品的HPLC Fig.1 HPLC chromatogram and characteristic peak assignment of the formula granules,the standard and single decoction and mixed reference compounds

将文件导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)》软件进行分析。剪切5 min图谱，以S1样品图谱为参照图谱，时间窗宽度设置为0.4，通过中位数法生成对照图谱及清胃散标准汤剂和配方颗粒的HPLC特征指纹图谱(图2和表2)，计算特征指纹图谱相似度。由图2和表2可知：15份标准汤剂样品(S1～S15)中有12份的相似度大于0.900，其余2份大于0.800，1份大于0.600。以标准汤剂为对照，3份配方颗粒样品(S16～S18)的相似度为0.870～0.888，说明质量相对稳定。

表2 清胃散标准汤剂与配方颗粒的特征指纹图谱相似度

图2 清胃散标准汤剂和配方颗粒的HPLC特征指纹图谱Fig.2 Characteristic fingerprint chromatograms of the standard decoction and the formula granules of Qingweisan

2.2 主要物质基础的含量测定结果

2.2.1 专属性和线性关系的考察结果

通过比对全方及单味药溶液的HPLC特征指纹图谱，对清胃散中各味药的特征色谱峰进行指认，发现专属性良好。以对照品进样质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到各指标性成分标准曲线的回归方程、相关系数及线性范围，结果见表3。由表3可知：各成分在质量浓度范围内的线性都比较好。

表3 清胃散标准汤剂中各主要物质基础的标准曲线

表4 9种成分的精密度、重复性、稳定性和加样回收率

2.2.2 方法学的考察结果

没食子酸、芍药苷、阿魏酸、异阿魏酸、表小檗碱、升麻素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和丹皮酚的精密度、重复性、稳定性和加样回收率结果见表4。由表4可知：该方法精密度、重复性和平均加样回收率良好，样品在25 ℃存放36 h，或在4 ℃存放7 d均稳定，符合定量分析要求。

2.2.3 主要物质基础的含量测定结果

根据线性回归方程，计算标准汤剂和配方颗粒溶液样品中没食子酸、芍药苷、阿魏酸、异阿魏酸、表小檗碱、升麻素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀以及丹皮酚的质量百分数(表5)。由表5可知：标准汤剂中平均质量分数为没食子酸(0.107 0±0.030 0)%，芍药苷(0.226 2±0.087 3)%，阿魏酸(0.030 7±0.007 5)%，异阿魏酸(0.089 5±0.032 0)%，表小檗碱(0.019 3±0.007 1)%，升麻素(0.009 3±0.003 0)%，盐酸小檗碱(0.058 3±0.027 0)%，盐酸巴马汀(0.028 0±0.011 6)%，丹皮酚(0.056 3±0.017 9)%；配方颗粒中平均质量分数为没食子酸(0.094 2±0.004 4)%，芍药苷(0.117 5±0.002 2)%，阿魏酸(0.013 5±0.000 9)%，异阿魏酸(0.054 6±0.004 5)%，表小檗碱(0.045 9±0.003 9)%，升麻素(0.004 5±0.000 7)%，盐酸小檗碱(0.214 5±0.020 2)%，盐酸巴马汀(0.072 8±0.004 6)%，丹皮酚(0.033 4±0.005 9)%。

表5 清胃散配方颗粒和标准汤剂各主要物质基础的质量分数测定结果

表6 清胃散标准汤剂和配方颗粒成分含量的OPLS-DA分析

2.2.4 单因素方差分析结果

显著性分析采用SPSS 22进行单因素方差(ANOVA)分析，清胃散标准汤剂和配方颗粒成分含量OPLS-DA分析见表6。由表6可知：配方颗粒溶液中指标性化合物表小檗碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的质量分数均值极显著(P<0.01)，高于标准汤剂；而阿魏酸的质量分数均值极显著(P<0.01)，低于标准汤剂；升麻素和芍药苷的质量分数显著(P<0.05)，低于标准汤剂。

2.2.5 多变量统计分析结果

将清胃散标准汤剂组和配方颗粒组中各指标性成分质量分数的标准化数据导入SIMCA-14.0软件，进行多变量统计分析。采用主成分分析(PCA)得分图直观表示组与组之间的差异；使用正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)分析，将标准汤剂组和配方颗粒组进行比对分析。通过PCA分析得到4个主成分的模型和反映各组离散程度的得分图(图3)。由图3可知：这4个成分分别为盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、表小檗碱、阿魏酸，能够反映清胃散配方颗粒与标准汤剂的差异，并能明显区分清胃散配方颗粒与标准汤剂。OPLS-DA图显示清胃散标准汤剂与颗粒剂区分明显，根据OPLS-DA分析的变量重要性投影VIP>1和ANOVA的P<0.05，筛选出清胃散标准汤剂组与配方颗粒剂组主要差异性成分为盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、表小檗碱、阿魏酸和升麻素。

图3 清胃散标准汤剂和配方颗粒PCA与OPLS-DA Fig.3 PCA and OPLS-DA diagram of the standard decoction and formula granules of Qingweisan

由表5～6和图3可知：清胃散配方颗粒与标准汤剂的主要指标性成分含量不一致。盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和表小檗碱是黄连的专属性成分，且含量较高，在配方颗粒中的含量极显著(P<0.01)，高于标准汤剂，提示配方颗粒与标准汤剂的差异主要体现在黄连这味药。

黄连生物碱合煎时转移率低可能是清胃散汤剂在临床使用时需添加剂量的原因之一。清胃散在《兰室秘藏》和《脾胃论》中都有记载：“如连不好，更加2分，夏月倍之”[8-9]。姚杭琦等[10]报道了黄连用药剂量也会依据临床患者的实际情况而有所增减。黄连作为清胃散的君药，主要发挥清胃热解火毒的主要作用[11]，小檗碱类生物碱成分如：表小檗碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀等为主要药效物质。前期实验中笔者发现：在制备标准汤剂后，表小檗碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的转移率较低，和黄嘉怡等[3]报道巴马汀在清胃散物质基准中转移率较低的结论相似。由此推测：黄连生物碱在合煎时，转移率较低可能与有机酸生成沉淀，影响溶出有关[12-14]，升麻、牡丹皮和当归中富含有机酸成分，如：没食子酸等成分可能影响黄连生物碱的溶出。依据本实验结果，清胃散配方颗粒中黄连的小檗碱类成分含量较标准汤剂更高，原因可能是配方颗粒是单味药提取干燥后所得，可保留更多生物碱成分，配方颗粒或更适合发挥清胃散清胃热的药效。

3 结论

目前针对清胃散配方颗粒或标准汤剂的主要物质基础研究尚不够全面系统，仅有少量文献涉及成分，如：阿魏酸、小檗碱、巴马汀、丹皮酚和芍药苷。本研究指认了清胃散标准汤剂中30个主要特征色谱峰的归属，以HPLC特征图谱相似度和主要物质基础的含量为指标，运用多变量统计分析方法评价了清胃散配方颗粒和标准汤剂的化学成分的一致性，为后续评价清胃散配方颗粒与标准汤剂生物效应的一致性研究提供了参考，并为经典名方配方颗粒的临床合理应用提供了示范性研究。