富磷生物炭协助溶磷细菌对Cu的修复机制

李 辰，陈颢明，，胡亦舒，赖韦唯，卢雨琦，娜扎发提·穆罕麦提江，闵芳芳，李 真

(1．南京理工大学 环境与生物工程学院，江苏 南京 210094；2．南京农业大学 资源与环境科学学院，江苏 南京 210094)

铜是一种生物微量元素，在许多生理过程中发挥重要作用。然而，随着采矿、工业加工等人类活动的增加，铜的过度使用已经造成了污染[1-2]，且Cu容易集中在土壤表层[3]，导致其对作物和地表水有直接危害。人体内的铜含量失衡会对神经系统、免疫系统、骨骼疾病和中性粒细胞减少症产生不利影响[4-5]。

微生物修复技术是最具潜力的修复技术之一，其具备无毒、无污染和持久性等特点。在众多具备修复功能的微生物中，利用溶磷微生物修复重金属已经取得显著成效。溶磷微生物能够依靠自身的代谢产物(有机酸、磷酸酶等)将难溶态磷转化，从而和重金属结合，改变重金属的形态，提高修复效率[6]。Li等[7]研究发现，溶磷细菌(Enterobactersp.)能够促进重金属磷酸盐矿物形成，从而成功去除重金属Pb(>90%)。Teng等[8]发现，溶磷细菌(Leclerciaadecarboxylata、Pseudomonasputida)能够通过形成羟基磷灰石和磷氯铅矿修复Pb污染。

虽然溶磷微生物经常用于重金属污染的修复，但它们本身在这个过程中会受到重金属的威胁。在一定程度上，重金属浓度过高会对细胞代谢产生抑制作用[9]。特别是铜离子具有螯合巯基的能力，干扰细胞中的蛋白质或酶的活性[10-11]。游离的铜离子参与活性氧的形成，从而危害微生物[12]。因此，面对重金属污染(尤其是铜离子污染)，微生物有必要与其他技术相结合。课题组的前期研究证明生物炭能够成功保护溶磷细菌免受高浓度Pb和Cd的胁迫[13-14]。生物炭的高比表面积和孔隙度使其具有较高的吸附能力[15]。同时，生物炭对微生物的亲和性和保护性也使其成为重金属胁迫下最优的微生物负载材料[14]。

因此，利用生物炭协助溶磷微生物修复Cu污染将会是一种具有潜力的方法。然而，在Cu胁迫下，生物炭如何对溶磷细菌进行保护还有待深入探讨。为了探讨生物炭与溶磷细菌联合修复重金属Cu的机制，本研究假设生物炭能够通过改变Cu的价态和矿物形态减少Cu2+对溶磷细菌的胁迫。采用电感耦合等离子光谱发射仪(ICP-OES)、X线衍射(XRD)、衰减全反射红外光谱(ATR-IR)、电化学、X线光电子能谱技术(XPS)和扫描电子显微镜及能谱分析(SEM/EDS)等技术定性和定量分析修复过程中生物炭上矿物的形成和形态。这项研究将物理修复方法与生物修复耦联起来，为多方法联合修复Cu污染提供理论和实践依据。

1 材料和方法

1.1 材料制备

本研究以干化后的城市污泥为原材料(浙江永康市城市污水处理厂,密西西比国际水务公司)，在600 ℃下高温热解制备成弱酸性生物炭(SB)，对比其他种类的生物炭，其磷含量十分高(表1)。

表1 不同类型生物炭基本性质和磷含量对比

溶磷细菌采用南京农业大学资源与环境科学学院从大豆根部(黄棕壤)筛选出的强溶磷功能菌株(肠杆菌,Enterobactersp.,菌株的保藏号为 CGMCC17428)。将菌种在30 ℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中活化培养3 d，然后从菌落中切下接种基块(直径6 mm)，并转接入100 mL液体牛肉膏蛋白胨培养基中。在30 ℃、180 r/min下孵育24 h后，大肠杆菌达到对数生长期后进行Cu修复试验。

1.2 Cu修复试验设计

以细菌培养专用有机环境为试验背景(LB培养基:1 000 mL蒸馏水、10.0 g胰蛋白胨、5.0 g酵母提取物和10.0 g NaCl)。使用0.1 mol/L NaOH将pH调至7.2～7.4。然后，将1 mL溶磷细菌菌液或者2.5 g生物炭加入50 mL LB培养基与1 000 mg/L Cu2+[(Cu(NO3)2]的混合污染溶液(处理:PSB+Cu、SB+Cu)。同时将2.5 g的生物炭与PSB混合加入Cu污染溶液(处理:SB+PSB+Cu)，并用无Cu的同样条件作为细菌对照(处理:SB+PSB)。将所有处理的烧瓶在黑暗的恒温培养箱中培养3 d(37 ℃、125 r/min)。将反应完成的菌液进行离心(7 000 r/min、3 min)和过滤(0.22 μm滤膜)。采用2.5%的戊二醛对生物炭上的微生物进行固定(4 ℃储存)。利用Agilent 710型ICP-OES分析了滤液中的总P和Cu2+浓度，固体在45 ℃下烘干后通过ATR-IR、XRD、XPS、SEM和电化学等技术进行分析。

1.3 分析方法

生物炭联合细菌吸附Cu2+后的电化学特性，利用CHI-660D型电化学工作站(中国上海辰华仪器)对不同处理吸附Cu2+后进行了循环伏安法研究。循环伏安法采用铂丝辅助电极(PFE)、饱和甘汞参比电极(SCE)和修饰后的玻碳电极(GCE)工作电极组成的三电极体系。适配传感器制备：使用0.3和0.05 μm粒径的α-Al2O3混合液体(0.25 g/mL)依次抛光GCE电极(直径5 mm)，然后在乙醇和超纯水中超声清洗，并用N2干燥。将生物炭/生物炭+菌的溶液(50 μL,20 mg/mL)分别包裹在GCE电极上，然后干燥成型(65 ℃,2 h)。将10 μL 0.5% Nafion溶液覆盖在带有样品的GCE电极上并在空气中干燥。SCE和PFE分别用作参比电极和对电极。在-0.8～0.8 V的扫描范围内，以10 mV/s的扫描速率研究了各个处理的电化学行为。

1.4 统计分析

每组试验设置3个重复，计算其平均值和标准偏差。采用SPSS 16.0进行单因素方差分析(ANOVA)，评价不同处理之间的差异(显著性水平P<0.05)。采用Thermo Scientific OMNIC软件进行红外数据分析，JADE 6.0进行XRD数据分析。XPS、SEM和电化学采用Origin 8.0进行分析和图形处理。

2 结果和讨论

2.1 生物炭联合溶磷细菌修复Cu的结果分析

生物炭联合溶磷细菌对重金属Cu的去除量和溶液磷含量如图1所示。由图1可知：与Cu胁迫处理相比，生物炭和溶磷细菌处理(SB+PSB)的磷含量最低(107.84 mg/L)，比SB+Cu(331.11 mg/L)释放的磷含量低了2倍多，因此证实溶磷微生物在无Cu胁迫和养分充足情况下，能够充分利用环境中的磷源，加速自身繁殖和生长。在Cu胁迫下，生物炭处理(SB+Cu)后，磷含量最高，溶磷细菌处理(PSB+Cu)效果比生物炭处理的低，对Cu的去除量最低，这证实溶磷细菌在Cu胁迫下会产生应激反应[9]，加速磷的释放。此外，结合ATR和XRD结果分析，推断磷可能被用于溶磷细菌繁殖和自身修复而不是用于和Cu结合固定。当生物炭协助溶磷细菌的时候(SB+PSB+Cu)，其磷含量明显降低，比溶磷细菌单独处理的降低27.9%，比生物炭单独处理的降低54.2%。而Cu的去除量比溶磷细菌单独修复高12 012.1%(约120倍)，比生物炭单独修复高123.9%，这表明溶磷细菌在生物炭保护情况下，将生物炭中的磷充分释放，从而降低环境中Cu的胁迫。

图1 生物炭协助溶磷细菌修复的反应体系中P含量和Cu含量Fig.1 Content of P and Cu in the reaction system assisted by biochar in phosphorus-soluble bacterial remediation

2.2 生物炭和细菌修复Cu的重金属矿化机制分析

ATR-IR红外光谱显示SB+PSB处理没有明显的碳酸盐(676 cm-1)[13]和磷酸盐(565和598 cm-1)[7,20]的峰存在，说明没有Cu胁迫时，溶磷细菌所分解的磷多用于自身繁殖。PSB+Cu处理组存在碳酸盐和磷酸盐矿物，而有机质类峰(1 550 cm-1)[14]和代表蛋白/糖类峰[9]十分明显，结合ICP-OES结果进一步证实，Cu对PSB胁迫十分明显，PSB只能够进行自我保护，而不能对Cu进行固定修复。

本研究中，在SB+PSB+Cu的沉淀物中存在碳酸盐和磷酸盐的多个峰(图2)，SB+Cu处理组的碳酸盐峰(676、876、1 421 cm-1)更加明显，由此表明生物炭自身可以对Cu起到一定的矿化固定作用，但还是以不够稳定的碳酸盐Cu矿物形式为主(Ksp=1.4×10-10～2.4×10-10)[21]。而生物炭联合溶磷细菌后不仅起到保护溶磷细菌的作用，还为溶磷细菌提供了充足的磷源，二者联合促进生成更加稳定的磷酸盐Cu矿物(Ksp=1.3×10-37～1.4×10-37)[21]。XRD结果与红外结果一致，通过图2(b)可以明显分析得出，生物炭与溶磷细菌联合比二者单独修复Cu污染的矿物晶体特性更明显且数量更多。同时，在沉淀物中发现可能同时存在不同价态矿物[22-23]，这说明生物炭表面可能是Cu价态转化的平台。

图2 生物炭和溶磷微生物联合修复Cu的ATR-IR(a)与XRD(b)图谱Fig.2 ATR-IR spectra(a) and XRD(b) patterns of Cu remediation by biochar and phosphorus-soluble microorganisms

图3为生物炭和溶磷细菌修复Cu的SEM照片。由图3可见，生物炭表面沟壑纵横，孔隙丰富(图3(a))，细菌能够藏匿在生物炭的孔隙中(图3(b))。这证实生物炭能够为微生物提供充分的定殖空间，并且EDS分析进一步表明在生物炭表面有明显的Cu矿物存在，充分说明生物炭表面是重金矿物的平台(图3(c)、3(d))，这与笔者先前的研究结果一致[13]。

图3 生物炭和溶磷微生物修复Cu的SEM与EDS图Fig.3 SEM images and EDS patterns of biochar and phosphorus-soluble microorganisms for Cu remediation

2.3 生物炭对微生物的保护和协助作用机制分析

具有多孔隙结构和大比表面积的污泥生物炭能够从环境中吸附并滞留微生物所需的氮、磷等元素，同时生物炭的孔隙也为微生物提供了生长繁殖的场所(图3(a))。本研究证实生物炭的存在，减少了约90 mg/L的Cu对微生物群落的胁迫(图1)，从而维持了微生物生命系统的稳定。而生物炭与微生物联合共同起到了加速钝化重金属的作用(图2)。虽然本研究发现，重金属矿物的形成是生物炭保护微生物的主要机制之一，但是在微生物层面的剖析仍需要进一步研究证明。

为了进一步探究生物炭协助下微生物学的自我保护机制，本研究采用电化学和XPS分析证明Cu是否有价态变化以及变化差异，结果如图4所示。电化学分析(循环伏安法)研究了4种材料(SB、SB+Cu、SB+PSB+Cu、PSB+Cu)在Cu胁迫下在0.1 mol/L磷酸盐平衡溶液(pH=7.0)中的电化学性质(图4(a))。由(图4(a))可知：在10 mV/s的扫描速率下，样品的光谱显示出明确的氧化还原峰，分别位于-0.5～-0.35 V(还原)和-0.02～0 V(氧化)处，对应于Cu2+/Cu+的可逆价态转变。电化学结果证实，吸附Cu2+后，细菌中存在明显将Cu2+转化为Cu+的电位，证实细菌具有还原性的生物学功能，而其氧化性电位十分低，因此证实其在Cu胁迫下主要是以还原性占主导。这就导致Cu2+往Cu+转变产生的毒性抑制了细菌的生存和繁殖，这与笔者先前的研究一致[9]。

由图4(b)可知：在SB+PSB+Cu处理的固体表面发现了2种不同价态的Cu离子存在，并且氧化和还原电位十分明显(图4(a))，这说明生物炭和细菌联合可以显著提高Cu价态变化，尤其是氧化性。而SB+Cu处理和SB处理的电化学结果进一步证实，生物炭自身具备一定的氧化效果，因此可以确定这一现象主要由细菌和生物炭联合引起的。对比单独细菌受胁迫时，细菌只有还原性功能，说明诱导细菌氧化功能提升主要源自于生物炭对Cu胁迫的降低。结合笔者先前的研究发现微生物体外分泌物具有氧化功能，可以得出：生物炭除了能够减少游离的Cu2+含量以外，还可能将微生物含有的Cu的分泌物吸引到生物炭上，增加细菌新分泌物的产生，从而减少微生物受到的毒害。

图4 生物炭复合细菌吸附Cu2+后的CV曲线(a)和XPS曲线(b)Fig.4 CV curve(a) and XPS curve(b) of biochar composite bacteria after adsorption of Cu2+

XPS结果表明在SB+Cu处理中Cu2+占67.5%，Cu+占32.5%。而在PSB+Cu中Cu+数量明显增多，占62.7%。这也进一步证明细菌对Cu的还原作用。此外SB+PSB+Cu实验表明Cu2+的比例高于Cu+，说明生物炭可以对Cu2+进行有限固定，而微生物的生物氧化作用促进了Cu+往Cu2+转变，从而进一步降低Cu胁迫。综上所述，生物炭首先能够减少细菌和Cu2+接触，降低Cu进入细胞后产生氧化还原作用引起的致毒性，从而最有效地保护微生物；然后，生物炭对Cu进行吸附+矿化结合，即使有部分Cu被微生物表面分泌物所氧化，但是生物炭能够将其争夺并固定，减少Cu离子和·OH进入细胞的概率，所以降低了Cu在微生物体内的胁迫效应。

3 结论

1)当生物炭协助溶磷细菌应对Cu2+胁迫的时候，二者联合对Cu2+去除量比溶磷细菌单独对Cu2+去除量提高12 012.1%(约120倍)，磷含量比生物炭单独降低54.2%，证实生物炭能够成功协助细菌提高生物功能，将P转化并与Cu结合，降低环境中Cu的危害。

2)生物炭具有丰富的孔隙，能够减少细菌和Cu2+接触，从而降低Cu2+进入细胞后产生氧化还原作用引起的致毒性，以此保护微生物在生物炭上先定植。

3)生物炭对Cu2+具有矿化结合功能，其能提前将Cu2+从环境中固定，减少被微生物还原的机会。

4)即使有部分Cu被微生物表面分泌物氧化成不同价态，但是生物炭能够将其争夺并固定，减少Cu离子和·OH进入细胞的概率，从而降低其在微生物体内的胁迫效应。