瑞德西韦聚合物纳米胶束的制备及表征

武海军，李玉凤，钟强，张广桃，马春雷，谢纪珍

(1.山东省食品药品审评查验中心，山东 济南 250013；2.青岛市市立医院，山东 青岛 266033;3.山东华铂凯盛生物科技有限公司，山东 济南 250098)

瑞德西韦(Remdesivir，GS-5734)，又名伦地西韦，结构式见图1，这是一种具有广谱抗病毒活性的核苷类似物。瑞德西韦作为一种前体药物，其进入宿主细胞后会代谢为具有药理活性的三磷酸核苷(nucleoside triphos phate，NTP)[1],随后被RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)识别，渗入病毒基因组的合成，使得磷酸二酯键无法形成，进而终止 RNA 链的合成，抑制病毒复制。瑞德西韦阻断病毒复制、发挥抑制病毒作用的方法有两种，其一是与三磷腺苷(ATP)竞争 RdRp，其二为阻止校正作用的核糖核酸外切酶发挥正常功能[2-4]。作为单磷酸前药，瑞德西韦结构中的苯酚和氨基酸酯可以掩盖单磷酸基团的负电荷，使其很容易地被动渗透到细胞中。在将单磷酸输送到细胞中时，可以有效绕过限速第一磷酸化步骤，从而显著提高母体核苷的效力。随后，胞内酯酶(如羧基酯酶-1和组织蛋白酶A)将酯分解为羧基结构，然后继续分解为单磷酸核苷，最后被磷酸化为三磷酸核苷发挥抗病毒效果[4]。瑞德西韦在体外实验中显示出对多种病毒的抑制作用，例如冠状病毒、丙肝病毒、人类免疫缺陷病毒和埃博拉病毒等[2,5]。目前，瑞德西韦用于埃博拉病毒感染治疗的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验已完成，未发现其有明显不良反应[4]；在 CN103052631B 和 CN105443098B 中瑞德西韦可以治疗呼吸道合胞病毒感染和副流感病毒感染[6-7]；在 CN107073005A 中瑞德西韦可以治疗丝状病毒科病毒感染[8]；在 CN108348526A 中瑞德西韦可以治疗拉沙病毒和胡宁病毒感染[9]；在 HAE 细胞中，瑞德西韦对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的EC50值为 74 nmol·L-1，在延迟脑肿瘤细胞中，对鼠肝炎病毒的 EC50值为30 nmol·L-1[3]。在 Vero E6细胞中，瑞德西韦可有效抑制 SARS-CoV-2 的感染，EC50为 0.77 μmol·L-1，选择指数(selection index，SI)>129[10]，这说明瑞德西韦在细胞水平上能对冠状病毒感染起到抑制效果。

图1 瑞德西韦分子结构

然而，瑞德西韦溶解性较差，它在水中溶解度大约 0.03 mg·mL-1，且化学不稳定，在pH约4～5之间的溶液最稳定，在pH为4或以下时，溶解度增加，这在美国专利 US20190083525 中也有确证[11]。除此之外，瑞德西韦溶解在含有有机溶媒的水溶液中，会随混合溶液中有机溶剂或增溶剂比例的下降而急剧下降，稀释过程中极容易析出，从而带来安全性问题。根据 US20190083525 描述及我们研究显示，采用吐温80或PEG300溶解瑞德西韦需要大量的吐温80或PEG300，且组成黏度大；采用无菌生产工艺样品难以过滤，而采用终端灭菌工艺会导致样品出现不稳定的问题，且临床应用时如果稀释10倍或者100倍，会导致瑞德西韦结晶析出、长期放置不稳定，同时会在体内造成溶血、超敏反应等问题[11]，这也是吉利德公司的没有选择吐温80作为增溶剂，而是选择了磺丁基倍他环糊精的原因。

根据美国专利 US20190083525 及相关文献报道，瑞德西韦冻干制剂除活性成分外，还包含以下非活性成分：注射用水，磺丁基-β-环糊精钠(SBECD),使用盐酸和/或氢氧化钠将制剂的pH调节至3.0至4.0，而后冻干[11]。瑞德西韦临床给药方式为：首日静脉给药200 mg，之后每天一次100 mg，30 min内完成，根据病毒载荷持续给药9～13 d[12]，这样的给药方式和瑞德西韦的药物代谢方式有关。在静脉给药后，瑞德西韦会进入细胞代谢成活性的GS-443902(见图2)。外周血单核细胞(PBMC)中研究表明，GS-443902的半衰期长达35 h以上[13]。根据WHO的报告[14]，瑞德西韦在3～225 mg范围内单次静脉注射给药2 h的情况下，其体内浓度具有线性的剂量相关性。早期研究显示在30 min内静脉内给予瑞德西韦75 mg提供与2 h内相同剂量相似的母体暴露水平，但GS-443902的PBMC暴露高于2 h内静脉给予瑞德西韦150 mg。该数据支持在30 min的较短时间间隔内给药，这是使活性代谢物GS-443902的细胞内水平最大化的更有效给药方式。外周血单核细胞(PBMC)中的GS-443902观察到细胞内半衰期超过35 h，这支持了每天一次的瑞德西韦给药。此外，细胞内代谢产物的累积比为2.7～3.5倍，首剂量瑞德西韦200 mg，每天重复瑞德西韦100 mg 维持剂量，保证了随后的GS-443902稳态PBMC水平的实现，对急性感染患者的治疗至关重要[15-16]。

图2 GS-443902化学结构式

截至目前，除了吉利德所报道的瑞德西韦环糊精冻干制剂，再无其他剂型报道，虽然现有剂型解决了瑞德西韦水溶性问题，并用于临床，但现有瑞德西韦剂型仍存在如下问题：①磺丁基-β-环糊精钠主要通过肾小球滤过作用在肾脏中排泄，总体上体内安全，但在肌酐清除率<50 mL·min-1或长期多剂量给药的情况下会出现肾小管空泡化的组织病理学改变，甚至出现肺泡沫细胞灶，肝坏死和肾小管堵塞[17]；②瑞德西韦疗效有剂量依赖性，应提高单核细胞对其吞噬效率、速率，以更好提高GS-443902稳态PBMC水平[13]；③COVID-19 病理特征CT影像显示大部分COVID-19 患者肺部出现病变，病灶部位多不规则。轻症患者肺部病变以磨玻璃密度影为主；重症患者肺部病变以磨玻璃密度影合并弥漫性实变影为主[18],多伴条索状阴影，部分为双肺病变，少数呈“白肺”状。经肺部活检，患者肺部均发生病理变化，包括：①肺部存在蛋白质渗出物；②气腔内存在大量免疫细胞；③肺部可见纤维蛋白；④肺泡上皮细胞增生，COVID-19对肺部损伤很重；此外COVID-19对肝、脾、肾都有影响。然而由于血浆中存在大量的水解酶，瑞德西韦在血浆中很不稳定。实验表明，瑞德西韦静脉注射后，在小鼠体内的血浆半衰期小于 5 min，恒河猴体内的血浆半衰期仅为 0.39 h[1,3]，在人体血浆中的半衰期为 1 h[19]。基于瑞德西韦的物理化学性质及其在组织血浆中的不稳定性，可以预计静脉注射后瑞德西韦在肺部组织中的分布和渗透率较低。在多项动物模型中，肺部均未检测到瑞德西韦，其活性代谢物的浓度也较低。因此应尽可能提高其病灶部位浓度，从而提高疗效。

基于上述问题，我们制备瑞德西韦(Remdesivir，GS-5734)聚合物纳米胶束粉针形态，在不需要磺丁基-β-环糊精钠(SBECD)及任何酸碱调节剂的情况下，就解决了瑞德西韦水溶性、物理、化学稳定性问题，重要的是所制备的瑞德西韦聚合物纳米胶束粉针剂复溶后，可自组装成 8～100 nm大小的粒子，有利于药物被动聚集在肺部，提高瑞德西韦的最大耐受剂量。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 瑞德西韦原料(山东华铂凯盛生物科技有限公司，批号:200413，含量：99.0%)；瑞德西韦普通注射剂(山东华铂凯盛生物科技有限公司，批号:200501，100 mg/瓶)；瑞德西韦对照品(山东华铂凯盛生物科技有限公司，批号:200319，含量：99.0%)；mPEG-b-PDLLA(山东华铂凯盛生物科技有限公司，批号:191208)；无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)。

1.2 仪器 试验所用仪器有旋转蒸发仪(杭州庚雨仪器有限公司，N-1100)；冷冻干燥机(上海亿倍实业有限公司，YB-FD-20D)；透射电子显微镜(日本电子株式会社，JEM-1200EX)；马尔文粒度测定仪(英国马尔文仪器有限公司，Nano S90)；X 射线衍射仪(德国布鲁克公司，D8 ADVANCE)；液相色谱仪(安捷伦1200)；电子天平(上海精密电子天平，FA1204B)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂，TGL-16G)；水浴恒温振荡器(国华企业，SHA-B)。

1.3 瑞德西韦聚合物胶束的制备及表征

1.3.1 瑞德西韦聚合物胶束制备 采用固体分散法制备瑞德西韦聚合物胶束[20]，先将瑞德西韦与mPEG-b-PDLLA按1∶9比例共溶于无水乙醇中，60 ℃水浴条件下减压蒸馏至溶剂全部蒸出，得到分散均匀聚合物基质，加入60 ℃预热的注射用水溶解基质即得瑞德西韦聚合物胶束溶液。将溶液用0.22 μm的微孔滤膜过滤，续滤液分装后冻干，置于4 ℃长期保存备用。

1.3.2 形态粒径表征 瑞德西韦胶束冻干粉用水分散后，滴于Formvar膜，室温下自然晾干后，用1%磷钨酸负染，室温晾干后，用透射电子显微镜(JEM-1200EX，JEOL)，于50 k倍下观察形态。瑞德西韦胶束冻干粉用水分散后，用马尔文激光粒度测定仪(Nano S90，Malvern)进行粒径测试，平行3次。

1.3.3 XRD单晶衍射测试 室温下，分别取200 mg空白mPEG-b-PDLLA聚合物载体材料、瑞德西韦、瑞德西韦胶束冻干粉、瑞德西韦与材料物理混合粉(1∶9)，置于玛瑙研钵适度研磨，取适量研磨细粉置于测试槽，并用干净载玻片涂抹均匀，用XRD单晶衍射仪(D8 ADVANCE)进行测试分析。射线为经镍滤过处理铜Kα辐射(λ =0.154 nm)，扫描范围为5o～50o，记录图谱并分析。

1.3.4 瑞德西韦含量测定 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18(4.6 mm ×150 mm,5 μm)，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.72 g，加水1 000 mL，搅拌溶解，用磷酸调节pH值至4.0)为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行线性洗脱；流速为每分钟1.0 mL；柱温为30 ℃；检测波长为240 nm；进样体积20 μL。精密称定相当于瑞德西韦10 mg的聚合物样品，置10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。取20 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图。另精密称定瑞德西韦对照品10 mg，置10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液，同法测定。

表1 洗脱梯度

1.3.5 载药量与包封的测定 精密称取相当于含瑞德西韦10 mg的聚合物纳米胶束冻干粉置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，超声溶解，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液照色谱条件进样，重复3次，按外标法计算。通过公式(1)、(2)计算瑞德西韦的载药量和包封率。

(1)

(2)

1.3.6 体外释放曲线测定 分别取含瑞德西韦浓度为0.5 mg·mL-1胶束水溶液以及瑞德西韦普通注射液各5 mL，置于透析袋中进行体外释放，平行3组。释放介质为0.1% CTAB水溶液35 mL ，置于37 ℃，100 r·min-1水浴恒温振荡器振摇。分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取释放介质1 mL，同时补入新鲜介质 l mL，照“1.3.4”项下色谱条件进样，采用外标法计算瑞德西韦累计释放度，绘制体外释放曲线。

2 结果

2.1 瑞德西韦聚合物胶束制备结果与形态表征 采用固体分散方法制备的瑞德西韦聚合物纳米胶束包封率、收率均很理想，复溶前及复溶后水溶液有明显蓝色乳光，符合丁达尔现象。图1A为瑞德西韦聚合物纳米胶束的冻干粉针剂形态，复溶共聚物后形成的胶束溶液澄清且具有浅蓝色乳光(见图1B)。图2马尔文激光粒度仪测定瑞德西韦聚合物纳米胶束复溶后的粒径，平均结果为(12.97±1.33)nm(见图2A)，多分散指数为(0.062±0.023)。经染色后的瑞德西韦胶束在透射电镜下粒子形态圆整，分散均匀，粒径在10～100 nm (见图2B)。但采用磺丁基-β-环糊精钠包裹的瑞德西韦普通制剂，其水溶液通过马尔文激光粒度仪测定，其粒径非常不均匀(见图3)。

A.瑞德西韦聚合物纳米胶束的冻干粉针剂;B.瑞德西韦聚合物纳米胶束水溶液图1 瑞德西韦聚合物纳米胶束

A.瑞德西韦聚合物纳米胶束水溶液马尔文测定粒径;B.瑞德西韦聚合物纳米胶束透射电镜图2 马尔文激光粒度仪测定瑞德西韦聚合物纳米胶束复溶后的粒径

图3 瑞德西韦普通注射剂(SBECD装载)水溶液马尔文测定粒径

2.2 XRD单晶衍射测试结果 XRD单晶衍射图谱如图4所示，MPEG-b-PDLLA空白材料在19 °及23 °有明显特征峰(见图4A)，瑞德西韦聚合物纳米胶束冻干粉(见图4B)与瑞德西韦和载体材料的物理混合粉(见图4C)在相同位置均存在明显的载体辅料特征峰，而纯瑞德西韦原料(见图4D)此处并无吸收，由此表明19°及23°位置峰为材料特征峰。同理，瑞德西韦原料在8～18°及22.5°存在峰高不等的峰(见图4D)，此为瑞德西韦特征峰，并且在瑞德西韦和载体材料的物理混合粉样品图中也有这些特征峰，相反，瑞德西韦聚合物纳米胶束冻干粉却没有瑞德西韦特征峰，说明瑞德西韦完全包裹在载体的内部，而不是吸附在外面，而采用物理混合的粉末(见图4C)有明显瑞德西韦特征峰(8～18°及22.5°)，这也验证瑞德西韦聚合物纳米胶束中的瑞德西韦是包裹在纳米胶束载体中。

A.载体mPEG-PDLLA;B.瑞德西韦聚合物纳米胶束冻干粉(RNM);C.瑞德西韦原料(Remdesivir);D.载体mPEG-PDLLA与瑞德西韦原料的物理混合粉(10∶90)的XRD衍射图谱图4 XRD单晶衍射图

2.3 载药量与包封率测试结果 图5为瑞德西韦聚合物纳米胶束的HPLC图谱，其主峰保留时间20.25 min，与前后杂质能够有效分离，同时瑞德西韦聚合物纳米胶束载药量与包封率测试结果见表2，其载药量平均值为(10.95%±0.33%)，瑞德西韦聚合物纳米胶束的包封率为(99.25%±0.86%)，说明我们的制备工艺具有较好的载药量与包封率。

图5 瑞德西韦聚合物纳米胶束的HPLC图

表2 载药量与包封率结果

2.4 体外释放 通过HPLC检测瑞德西韦从聚合物纳米胶束与普通瑞德西韦注射液(SBECD包裹)在0.5%(W/V)吐温-80的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)介质中的释放行为。如图6所示，瑞德西韦聚合物纳米胶束在24 h药物只释放了60%，而普通瑞德西韦注射液在3 h内药物释放已达85%以上，表明瑞德西韦聚合物纳米胶束具有明显的缓释效果。

图6 (▲)普通瑞德西韦注射液和(■)瑞德西韦聚合物胶束体外释放曲线(n=3)

3 讨论

本文采用生物可降解mPEG-b-PDLLA聚合物材料，利用固体分散法制备瑞德西韦纳米聚合物纳米胶束，极大提高了瑞德西韦的水中溶解度。其载药机理是由于系统自由能的降低即疏水作用引起聚合物材料自组装，形成疏水部分-亲水部分的“核-壳”结构，组装的同时药物被包载于疏水内核。磺丁基-β-环糊精钠主要通过肾小球滤过作用在肾脏中排泄，剂量过大会出现肾小管空泡化的组织病理学改变，而瑞德西韦聚合物纳米胶束粒径8～100 nm且分布均匀，形态圆整，肾脏的清除阈值为5～6 nm，瑞德西韦聚合物纳米胶束可以避免肾脏清除，消除了磺丁基-β-环糊精钠在肾脏蓄积问题；同时平均粒径为(12.97±1.33)nm的粒子在肺部会有大量聚集，这对提高肺部药物聚集，提高药效无疑是有意的。

瑞德西韦与载体材料构成稳定疏水内核，载药量高，包封性好，无药物突释现象，且通过载体减小药物透过和扩散系数，使药物释放达到缓释效果。2020 年 10 月 FDA 批准吉利德公司的瑞德瑞德西韦普通注射剂Veklury[21]，尽管在目前的临床数据中显示出了益处[22]，其疗效仍然是有限的。2020 年 11 月 20 日，世界卫生组织(WHO)于英国医学杂志 BMJ 更新了关于新冠肺炎治疗药物指南[23]，指出无论病情轻重，指南均不推荐新冠肺炎住院患者使用瑞德西韦，确证瑞德西韦不是新冠肺炎最优选药物，但考虑其存在多种适应证，构建其新的递送系统，对开发其新的适应证提高疗效仍然会有重要意义。