丹参茎叶原药材产地加工及质量标准建立

钟林江，张 佳，刘晓凤，杨俊莉，邓 妍，刘 涛

(1.成都大学 四川抗菌素工业研究所，四川 成都 610106；2.四川科伦药业股份公司，四川 成都 610106；3.民办四川天一学院，四川 绵竹 618200；4.成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106)

丹参茎叶为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的茎和叶，约占丹参植株鲜质量的66%，在丹参采收期常被丢弃，造成丹参资源的浪费[1]，随着丹参用量的不断增加，丹参茎叶的浪费量也不断加大。丹参分布广泛，丹参产量大的地区主要有河南、山东、四川、山西、陕西、江苏和安徽等省份，不同地区丹参质量差异较大[2]；在历年的丹参抽查检验中发现，由于加工方法的不同，丹参质量也有较大差异，丹参茎叶与丹参同株，在产地加工过程中最大限度地减少丹参茎叶主要有效成分分解与流失的研究具有重要意义[3-4]。

丹参茎叶中所含成分主要为丹酚酸类水溶性化合物，现代药理实验表明，丹参茎叶具有活血化瘀、抗氧化等功效[5-8]。丹参茎叶药材质量标准未载入现行版《中国药典(一部)》(2020版)中，所以质量控制水平不高。本研究以新采收鲜丹参茎叶为研究对象，通过简单的前处理，设计鲜丹参茎叶不同加工方法，优选加工方式，减少药效成分的损耗；对丹参茎叶的质量进行控制，参照《中国药典(一部)》(2020版)中的相关检测项[9]，建立丹参茎叶水分(质量分数)、水溶性浸出物、灰分限度等常规检查项的标准，同时建立相应的薄层色谱鉴别方法、高效液相色谱法对丹参茎叶中的丹酚酸B及迷迭香酸进行含量测定，以期为丹参茎叶的加工、有效储存和后续研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

DZTW型电子调温电热套，天津市静海县工兴电器厂；BS-6KH型电子天平，上海友声衡器有限公司；FA 2004型分析电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；101-1-S型电热鼓风干燥箱，成都雅源科技有限公司；RE-501型旋转蒸发仪、SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵，成都康宇科技有限公司；DZF-6050A型真空干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司；TD1000W型电子万用炉、SX2-12-10型箱式电阻炉，北京市永光明医疗仪器有限公司；P230Ⅱ型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 试剂与材料

丹参茎叶批次1(20180101、20180102、20180120、20180128、20180202、20180622、20180623和20190108)，四川德阳中江县集凤镇林家沟村；丹参茎叶批次2(20200106)，四川巴中巴州区方山雁村；磷酸(分析纯)、甲醇和乙腈(色谱纯)，成都市科隆化学品有限公司；迷迭香酸对照品(HPLC级)、丹酚酸B对照品(HPLC级)、咖啡酸对照品(HPLC级)、芦丁对照品(HPLC级)、原儿茶醛对照品(HPLC级)，四川省维克奇生物科技有限公司；水为纯净水。

1.3 丹参茎叶产地加工方法

1.3.1 丹参茎叶前处理

2批丹参茎叶分别采自四川省德阳市中江县集凤镇林家沟村1组(批号20180101)和11组(批号20180102)，新鲜的丹参茎叶经切成3 cm的段状，每批丹参茎叶按质量均分成6份，每批分别采用40 ℃恒温烘干、50 ℃恒温烘干、60 ℃恒温烘干、40～60 ℃梯度烘干、阴干、晒干。按照《中国药典(四部)》(2020年版)中0832法项的要求测定水分。

1.3.2 丹参茎叶含量测定方法

供试品的制备：平行取12份丹参茎叶粉末，每批取约1 g，精密称定后置于100 mL具塞锥形瓶中，精密移取体积分数80%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(140 W，42 kHz)30 min后放置冷却，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得样品。

对照品的制备：取迷迭香酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加入80%甲醇分别制成74.53 和10.00 μg/mL的溶液，即得对照样品。

色谱条件[4]：色谱柱为Supersil ODS2色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～8 min 16%～18% A、8～25 min 18%～35% A、25～38 min 35%～44% A、38～58 min 44%～40% A、58～70 min 40%～16% A、70～72 min 16%～16% A)，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为280 nm，进样量为10 μL。

1.4 丹参茎叶质量标准建立方法

1.4.1 水溶性浸出物的测定

参照《中国药典(四部)》(2020版)通则中2201冷浸法测定水溶性浸出物的方法。取丹参茎叶粉末约3 g(过三号筛)，精密称定后置于250 mL的锥形瓶中，精密加水100 mL，密塞，冷浸，前6 h内不断振摇后，再静置18 h，用干燥滤器迅速过滤，精密量取续滤液20 mL，置于已干燥至恒质量的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干后，转移至105 ℃鼓风干燥箱内干燥3 h，再置于干燥器中冷却30 min，精密称定质量。

1.4.2 总灰分的测定

参照《中国药典(四部)》(2020版)通则中2302测定总灰分的方法。取丹参茎叶粉末约4 g(过三号筛)，置炽灼至恒质量的坩埚内，精密称定，用电子万用炉缓缓炽热，至完全碳化时(碳化由黑色至白色时)，缓缓转移至箱式电阻炉，逐渐升高温度至550 ℃，使完全碳化至恒质量，根据残渣质量，计算供试品中总灰分含量(质量分数)。

1.4.3 酸不溶性灰分的测定

取所得总灰分，在坩埚中小心加入稀盐酸10 mL，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10 min，表面皿用热水5 mL冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，用AgNO3溶液检测洗涤的滤液不显氯化物为止。滤渣连同滤纸转移至同一坩埚中，用电子万用炉炽灼至全部碳化为白色，缓缓转移至箱式电阻炉，逐渐升高温度至550 ℃，使完全碳化至恒质量，根据残渣质量，计算供试品中酸不溶性灰分含量(质量分数)。

1.4.4 丹参茎叶TLC薄层鉴别方法的建立

对照品溶液的制备：取迷迭香酸及丹酚酸B对照品适量，精密称定，加入80%甲醇分别制成1.12和2.00 mg/mL的溶液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取丹参茎叶粉末0.2 g，加甲醇-水溶液(体积比为3∶ 1)25 mL，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至1 mL作为供试品溶液。

展开剂的制备：分别吸取乙酸丁酯-甲酸-水溶液(体积比为10∶ 2∶ 3)共30 mL于展开缸，加盖密闭10 min，即得。

展开：用经无水乙醇清洗后的毛细吸管吸取上述3种溶液(对照品丹酚酸B、迷迭香酸、供试品溶液)各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，缓缓放入装有展开剂的展开缸中，展至约8 cm后取出，晾干，在紫外灯光(365 nm)下检视。

1.4.5 丹参茎叶含量测定方法的建立

对照品的制备：取迷迭香酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加入80%甲醇制成223.0 μg/mL迷迭香酸和135.9 μg/mL丹酚酸B的对照品溶液。

供试品的制备：取丹参茎叶粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，超声处理(140 W，42 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：色谱柱为Supers:1 ODS 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，等度洗脱为乙腈-0.1%磷酸溶液(体积比为22∶ 78)，流速为1.2 mL/min，波长为265 nm，进样体积为10 μL。

1.4.6 方法学考察

精密度：取丹参茎叶粉末(过三号筛，批号为20180101-1，下同)约0.5 g，制备供试品溶液，然后按照色谱条件进行含量测定，精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，

稳定性：取丹参茎叶粉末约0.5 g，制备供试品溶液，然后按色谱条件进行含量测定，精密吸取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12和24 h后进样。

重复性：取丹参茎叶粉末约0.5 g，精密称定，平行制备供试品溶液6份，然后按照色谱条件进行含量测定，样品质量换算后，计算单位峰面积相对标准偏差(RSD)值。

线性关系：配制高浓度迷迭香酸对照品溶液，稀释为5个梯度浓度的溶液，配制高浓度丹酚酸B对照品溶液，稀释为6个梯度浓度的对照品溶液，分别进行液相色谱测定其含量(质量分数)。

含量测定：取不同批次丹参茎叶药材粉末(过三号筛)约0.5 g，平行制备9份供试品溶液后利用色谱条件测定其含量。

2 结果与讨论

2.1 丹参茎叶产地加工结果

将干燥后的丹参茎叶编号，林家沟村1组编号分别为180101-1、180101-2、180101-3、180101-4、180101-5和180101-6；林家沟村11组编号分别为180102-1、180102-2、180102-3、180102-4、180102-5和180102-6，分别打粉后过三号筛，测定水分，结果详见表1。由表1可知：不同干燥方式的水分差异较大，依据平均值的±20%规定其限度，规定最终丹参茎叶中的水分含量都不超过12%，符合《中药质量标准研究制定技术要求》[10]中的相关要求。

表1 丹参茎叶水分测定结果

2.2 不同产地丹参茎叶药材最优加工方法结果

以主要成分迷迭香酸与丹酚酸B含量为指标，采用高效液相色谱法对迷迭香酸和丹酚酸B进行含量测定。将丹酚酸B对照品溶液、迷迭香酸对照品溶液和12批供试品依次注入高效液相色谱仪，得到各批次有效成分峰面积，经计算后得到迷迭香酸和丹酚酸B的含量进行1∶ 1综合加权评分，详见表2。

表2 12批丹参茎叶药材有效成分

由表2可知，两个产地的阴干的综合加权评分分别为100.00和85.90，平均为92.95；梯度烘干时的综合加权评分分别为83.83和96.25，平均为90.04，说明阴干时丹参茎叶的迷迭香酸与丹酚酸B含量都较高。梯度烘干(40～60 ℃)效果次之，低温等度烘干对丹参茎叶中迷迭香酸和丹酚酸B含量有一定的影响。此外，晒干对丹参茎叶有效成分含量影响较大，同一批次丹参茎叶，与阴干相比，迷迭香酸减少了10.18 mg/g，在采收加工时应注意避免阳光暴晒。

阴干时的综合加权评分最高，梯度烘干(40～60 ℃)次之，同时考虑到梯度烘干较麻烦且浪费能源，增加成本，且在大规模进行烘干时，不易在一定时间内控制其温度，造成不同批次质量差异较大。阴干虽然耗时较长，但对丹参茎叶中迷迭香酸和丹酚酸B含量影响较小，还能节约能源，所以选取阴干为最佳干燥方式。

2.3 丹参茎叶质量标准

2.3.1 水溶性浸出物结果

丹参茎叶后期拟开发为生物肥料，因此本研究测定了其水溶性浸出物的含量，结果见表3。由表3可知：各批次间的水溶性浸出物含量差异不大，都在24.35%～26.51%范围内，依据平均值的±20%规定其限度，并规定最终丹参茎叶中的水溶性浸出物都不少于21%，可见此结果符合《中药质量标准研究制定技术要求》中的相关要求。

表3 水溶性浸出物测定结果

2.3.2 灰分标准的建立

灰分是指药材经高温灼烧后残留下来的无机物，灰分指标可以评定药材是否被污染或掺假。如果灰分含量超标，说明了原药材中可能混有杂质或在加工过程中可能混入一些泥沙等污染物。本研究测定了丹参茎叶的总灰分含量，结果见表4。由表4可知：各批次间的灰分含量在11.28%～12.96%范围内，差异不大，依据平均值的±20%规定其限度，并规定最终丹参茎叶中的灰分含量都不少于13%，此结果符合《中药质量标准研究制定技术要求》中的相关要求。

表4 总灰分测定结果

2.3.3 酸不溶性灰分结果

酸不溶性灰分指标能表明污染的泥沙和药材中原来存在的微量氧化硅等物质的量。本研究在总灰分的基础上，测定其酸不溶灰分的含量，结果见表5。根据残渣质量，计算供试品中酸不溶性灰分含量。由表5可知：各批次间的酸不溶灰分含量在1.09%～2.06%范围内，差异不大，依据平均值的±20%规定其限度，并规定最终丹参茎叶中的酸不溶灰分都不少于1.81%，此结果符合《中药质量标准研究制定技术要求》中的相关要求。

表5 酸不溶性灰分测定结果

2.3.4 丹参茎叶TLC薄层鉴别方法结果

薄层色谱法(TLC)是根据比移值(Rf)来进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法，更是一种快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。采用薄层色谱法对丹参茎叶中的活性物进行分析，结果如图1所示。由图1可知：供试样品与标准品的斑点与位置(Rf值一致)一致，显现相同颜色的荧光斑点，说明采用TLC法可快速鉴别丹参茎叶中的迷迭香酸和丹酚酸B。

1—丹酚酸B对照品；2—迷迭香酸对照品；3～4—供试品图1 丹参茎叶TLC分析结果Fig.1 TLC diagram of stem and leaf of S. miltiorrhiza

2.3.5 丹参茎叶含量(HPLC)测定方法及结果

为了更精确测定丹参茎中迷迭香酸和丹酚酸B的含量，建立HPLC分析方法，通过改进流动相种类、检测波长和供试品制备方法，以出峰时间和分离度为指标，最后确定含量测定条件，并进行HPLC分析方法学的考察。迷迭香酸、丹酚酸B对照品液相HPLC色谱图详见图2。供试品溶液HPLC色谱图详见图3。由图2～3可知：丹酚酸B和迷迭香酸出峰良好，分离度达到要求，同时在供试品色谱中，两种成分出峰时间与对照品色谱相同，经对照品指认，峰1和2分别代表迷迭香酸和丹酚酸B，其他峰为其他活性物质峰，由于条件有限，未进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析。因此在后续研究中，将对其他峰所代表的活性物质进行分析。所以在该色谱条件下，仅可用于测定丹参茎叶中的丹酚酸B及迷迭香酸的含量。

图2 迷迭香酸、丹酚酸B对照品HPLC色谱图Fig.2 HPLC diagram of rosmarinic acid and salvianolic acid B as control substances

图3 供试品HPLC色谱分析Fig.3 HPLC chromatogram of the tested product

精密度结果见表6，并计算其RSD。由表6可知：迷迭香酸峰面积RSD值为2.43%，丹酚酸B峰面积RSD值为4.35%，表明仪器精密度良好。

表6 丹参茎叶含量测定精密度结果

稳定性结果见表7，计算其RSD值。由表7可知，迷迭香酸峰面积RSD值为4.72%，丹酚酸B峰面积RSD值为5.07%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

表7 丹参茎叶含量测定稳定性结果

重复性结果见表8，对样品进行质量换算后，计算单位峰面积RSD值。由表8可知，迷迭香酸峰面积RSD值为9.33%，丹酚酸B峰面积RSD值为4.32%，表明该方法重复性良好。

表8 丹参茎叶含量测定重复性结果

迷迭香酸线性考察结果见表9，并以纵轴为迷迭香酸对照品峰面积，横轴为迷迭香酸对照品浓度，建立坐标轴，得到迷迭香酸对照品线性回归方程Y=6 452.3X-44 448，R=0.999 9。由表9可知：迷迭香酸的质量浓度在22.64 ～679.00 μg/mL范围内线性关系良好，可适用于丹参茎叶中的迷迭香酸含量测定。

表9 丹参茎叶含量测定迷迭香酸线性结果

丹酚酸B的线性考察结果见表10，并以纵轴为丹酚酸B对照品峰面积，横轴为丹酚酸B对照品浓度，建立坐标轴，得到丹酚酸B对照品线性回归方程Y=7 667.5X-157 527，R=0.999 8。由表10可知：丹酚酸B的质量浓度在25.81 ～826.00 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，可用于丹参茎叶中丹酚酸B的含量测定。

表10 丹参茎叶含量测定丹酚酸B线性结果

2.3.6 不同批次丹参茎叶含量测定结果

取不同批次丹参茎叶药材粉末(过三号筛)约0.5 g，制备供试品溶液，平行制备9份供试品溶液测定其含量，结果见表11。由表11可知：各批次间的迷迭香酸及丹酚酸B含量差异相对较大，平均值分别为0.76%和0.29%。依据平均值的±20%规定其限度，规定丹参茎叶中迷迭香酸和丹酚酸B的含量分别不低于0.61%和0.23%。，符合《中药质量标准研究制定技术要求》中的相关要求。

表11 9批丹参茎叶含量测定结果

参照《中国药典》(2020年版)的相关项，对丹参茎叶水溶性浸出物的量、总灰分含量及酸不溶性灰分含量制定标准，制定采用薄层色谱法对丹参茎叶进行鉴别的方法及采用高效液相色谱法对迷迭香酸和丹酚酸B含量测定方法，方法学考察结果表明本方法稳定可行。测定9批次丹参茎叶丹迷迭香酸和丹酚酸B含量并规定其限度。结果发现：不同产地丹参茎叶中迷迭香酸和丹酚酸B含量有明显差异。为防止丹参茎叶资源以次充好，建立其质量标准，并对其规定限度是极有必要的。《中国药典(一部)》(2020年版)中丹参项下丹酚酸B“含量测定”规定，在丹参干燥品中，含丹酚酸B不得少于3.0%。而在本研究中规定，丹参茎叶干燥品中，含丹酚酸B不得少于0.23%。对丹参和丹参茎叶中主要成分含量下限进行比较，与丹参相比，丹参茎叶丹酚酸B含量偏低，且含有不低于0.61%的迷迭香酸，但丹参茎叶中不含丹参酮类成分，可以推断，丹酚酸B主要存在于丹参形成层以内，部分存在与丹参茎叶中。经查阅文献[11-12]，丹参酮主要存在于丹参形成层以外(即根皮部分，包括丹参须根)，进一步验证上述猜想的正确性。

3 结论

对丹参茎叶产地加工方法进行考察，结果表明，阴干最为适合，也符合目前绿色、节能的发展要求。研究所建立的水分、水溶性浸出物、总灰分及酸不溶性灰分标准能较好地控制丹参茎叶原药材的质量。建立的薄层色谱法对丹参茎叶药材进行鉴别，采用高效液相色谱法对其进行含量测定，按干燥品计算，丹酚酸B(C36H30O16)和迷迭香酸(C18H16O8)分别不得少于0.23%和0.61%。初步研究结果发现，不同产地丹参茎叶质量有明显差异，在后续研究过程中，将采收不同地区多批次丹参茎叶进行建模，为丹参茎叶的进一步开发(有机肥、饲料、兽药和化妆品等)提供了实验依据。