HPLC-MS/MS法检测降压类中药制剂中非法添加的3种化学药品
2023-01-15刘文博裴晓芬申国华
赵 静，张 禄，刘文博，裴晓芬，申国华
(山西省检验检测中心，药品检验技术研究所，太原 030031；*通讯作者,E-mail:sxczhfsgh@sina.com)
伴随着经济、社会的不断快速发展进步，高血压发病率呈低龄化、逐渐增加的趋势，已成为我国乃至世界重要的公共卫生问题[1]。降压类化学药品起效快，治疗效果明显，目前临床应用普遍，需长期服用，但同时具有很强的依赖性、停药效应以及对人体脏器的的损害等副作用[2]，这使得人们对低毒、损害小的中药降压制剂以及辅助降压的保健食品受到追捧，不法厂商抓住人们的这一心理需求，并受巨大利益驱使，其在这类制剂中非法添加降压类化学药品，以夸大疗效；但其添加的化学药品的品种、剂量、纯度、组合很随意，根本不顾及给患者带来的身心上伤害，且是长期服用，除造成耽误患者的病情外，还使其身体受到很大的危害。因此，有必要制定相应的检测方法，为监管部门打击这种违法行为提供技术支持。
目前，虽然相关文献已有不少相关检测方法的刊载[3-5]，同时国家相关部门也已下发补充检验方法[6-7]，但是不法分子的添加方式、化学药品的成分也在不断更新，其故意回避上述文献及补充检验方法中所涉及的化学药品成分，以避免被监管部门查处。本文所涉及到的组合非法添加的3个化学药品成分为曲克芦丁、美托拉宗、阿齐沙坦，其中曲克芦丁为目前我国药品标准中已收载的品种；美托拉宗属于噻嗪类利尿剂，国内还未上市，正处于申报阶段；阿齐沙坦为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(沙坦类)的药物，这些化学药品临床上多用于治疗高血压症。本文采用液相色谱法定性并定量、液质联用定性确证的方法，针对中药制剂及保健食品，以期达到可以同时检测这3种非法添加化学药品的目的。
1 仪器与试药
Waterse2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Quintix224电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)，DV215CD电子天平(美国奥豪斯),Thermo Q-Exactive高分辨液质联用仪(美国赛默飞)、ESI离子源；SHISEIDO C18色谱柱(日本资生堂)(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Dikma Spursil C18(德国迪马)(150 mm×2.1 mm,3 μm)柱；甲酸为色谱纯，乙腈为色谱纯(Dikma公司)，水为纯化水，其余试剂均为分析纯；曲克芦丁(Troxerutin)，批号100416-201607，纯度97.5%，购自中国食品药品检定研究院；美托拉宗(Metolazone)，批号21081338，纯度99.5%，购自北京坛默质检科技股份有限公司；阿齐沙坦(Azilsartan)，批号13552，纯度98.98%，购自QCS标准物质研发中心；所用供试品为举报样品(主要原料为：人参、决明子、葛根、蛹虫草、栀子、菊花等)，批号为：LOT 425F0021，产地：江苏省无锡市。
2 方法与结果
2.1 色谱、质谱条件
2.1.1 液相定性及定量色谱条件 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm),柱温30 ℃；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；流速：1.0 ml/min；二极管阵列检测器(DAD)，波长范围190～400 nm；进样体积10 μl。梯度洗脱程序为：0～5 min，11%的乙腈；5.1～20 min,11%～60%的乙腈；20.1～25 min，60%～11%的乙腈。
2.1.2 液质联用定性色谱条件 C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)柱，柱温30 ℃；流动相：同“2.1.1”；流速：0.2 ml/min；进样体积10 μl。梯度洗脱程序为：0～10 min,20%～90%的乙腈；10.1～11 min，90%～20%的乙腈。
2.1.3 液质联用定性质谱条件 质谱配有电喷雾离子源(ESI)，质谱检测参数：ESI+扫描，干燥气温度：320 ℃，鞘气流速30 arb，辅助气8 arb，喷雾电压3.5 kV，碰撞能量20 cid；扫描方式：一级质谱全扫描、二级质谱全扫描，扫描范围m/z50～800。
2.2 标准曲线的制备
精密称取上述曲克芦丁、美托拉宗、阿齐沙坦3种对照品适量，用甲醇溶解，制成1.0 mg/ml的单标对照品溶液，作为储备液。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 固体制剂 取样品适量，混匀，精密称取相当于一次口服剂量的供试品(蜜丸类可加入等量硅藻土进行研磨处理；若未标明一次口服剂量，建议取样量范围为1～2 g)，置25 ml量瓶中，加甲醇20 ml，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，取出，放冷，用甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.2 液体制剂 取样品混匀，精密量取5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇15 ml，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)5 min，取出，放冷，用甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系
精密量取“2.2”项下储备对照品溶液,用甲醇分别稀释成从0.005 mg/ml至0.2 mg/ml范围内的梯度混合对照品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积面积为纵坐标，计算所得回归方程分别为：Y=13 998 639.14X-10 700.77，Y=50 796 992.87X+546.94，Y=28 128 592.29X+3 691.79，R2的值均大于0.999 8，可见3种成分在0.005～0.2 mg/ml范围内呈良好线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取线性中间浓度对照品溶液，连续进样6次，结果显示，3种化学成分峰面积的RSD(相对标准偏差)值均小于0.9%，表明仪器精密度满足要求。
2.6 定量限及检出限
将“2.3”制备的供试品溶液逐级稀释，过滤后进样，以峰高信噪比10 ∶1的对照品浓度为定量浓度，带入称样量及定容体积后折算定量限，曲克芦丁、美托拉宗、阿齐沙坦分别为22.4，18.3，21.6 μg/g；同法以峰高信噪比3 ∶1的对照品浓度为检出浓度，折算检出限，3种成分分别为10.1，7.5，8.6 μg/g。
2.7 稳定性试验
取“2.3”制备的供试品溶液，在制备完成后，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，结果显示3种成分的峰面积的RSD值均小于0.8%，表明供试品溶液在48 h内基本稳定。
2.8 重复性试验
取6份上述样品，分别按“2.3”方法制备样品溶液，计算含量结果，分别为3.6，1.3，6.8 mg/g，且对应的RSD值均小于2.1%。
2.9 回收率试验
采用加样回收的方法，精密称取上述已知3种成分含量的阳性样品，减半取样9份，分别计算添加80%，100%，120%加三水平的对照品，使制成的回收溶液浓度在线性范围内，按“2.3”项下样品溶液制备方法制备，计算回收率,结果分别为98.3%，98.8%，99.1%，RSD均≤0.9%。
2.10 对照品及阳性样品定性色谱及对应紫外光谱结果
阳性样品溶液中出现与“2.2”项下的3种对照品保留时间相同的色谱峰，且相应的紫外光谱图与上述3种对照品的光谱图一致(见图1A，B)。
2.11 专属性试验
取处方中人参、决明子、葛根、蛹虫草、栀子、菊花等药味，按《中国药典》2020年版一部项下的【制法】规定，模拟制成阴性样品，再依“2.3.1”项下制成阴性样品供试品溶液，照“2.1”项下所述色谱方法进行检测，色谱结果表明，供试品溶液色谱中，在与曲克芦丁、美托拉宗、阿齐沙坦3种对照品相同的保留时间处，无相应的色谱峰，见图1C。
1.曲克芦丁；2.美托拉宗；3.阿齐沙坦图1 3种对照品、阳性样品色谱及对应紫外光谱图及阴性样品溶液色谱图Figure 1 Chromatograms and their corresponding UV spectra of three reference substances and positive sample,and chromatogram of negative sample
2.12 液质定性特征离子峰及质谱图
将“2.10”的阳性供试品溶液，用乙腈稀释10倍以后，用质谱进行确证，结果表明，供试品中出现与曲克芦丁、美托拉宗、阿齐沙坦3种对照品相一致的一级、二级质谱图，样品的二级质谱图见图2-4。
曲克芦丁对照品及样品[M+H+]m/z见图2,一级质谱母离子为743；二级质谱分子离子碎片为435，597，581。
图2 曲克芦丁二级质谱图Figure 2 Troxerutin MS2 spectra
美托拉宗对照品及样品[M+H+]m/z见图3,一级质谱母离子为366；二级质谱分子离子碎片为259，277，211，178。
图3 美托拉宗二级质谱图Figure 3 Metolazone MS2 spectra
阿齐沙坦对照品及样品[M+H+]m/z见图4,一级质谱母离子为457；二级质谱分子离子碎片为233，279，251，207，267，180。
图4 阿齐沙坦二级质谱图Figure 4 Azilsartan MS2 spectra
3 讨论
本文为降压类中药制剂及保健食品中非法添加化学药品方法的研究[8，9]，可以作为此类制剂非法添加化学药品的通用检测方法，其不仅适用于中药制剂及保健食品中非法添加降压类化学药品的准确检测，也适用上述类别制剂的快速定性筛查；由于中药制剂中的成分比较复杂，添加化学药品不容易很容易被忽视或漏检，这就要求在日常检验工作中要有“研究型检验”的理念，不断的研究创新，以适应不断变化的非法添加化学药品检测的需求；另外，本方法也能为药品、食品及保健食品的监管以及规范市场行为，提供技术支撑，对维护人民大众的饮食用药安全，具有很大的现实意义。
