有氧运动对老龄小鼠心肌损伤及钠尿肽cGMP-PKG信号通路的影响

常 盼，于 军，王建榜，张 静，陈伟国，刘建荣*

(1西安医学院第二附属医院中心实验室，西安 710038；2陕西省心血管内科疾病临床医学研究分中心；*通讯作者,E-mail:49532697@qq.com)

衰老是重要的健康风险因素之一，也是大多数疾病，尤其是心血管疾病的主要危险因素。衰老可使多种代谢性疾病和心血管疾病的发生率增高，如冠状动脉疾病、高血压、肥胖、胰岛素抵抗(代谢综合征)、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化和中风等，进而导致老龄人的患病率和死亡率提高[1-3]。研究表明，一定强度的运动训练对老龄人群健康具有明显的益处[4]。运动可降低老年相关心血管疾病的发生率，其潜在机制不仅仅是减少心血管危险因素，还包括改善血管内皮功能、抗氧化能力、抗炎症反应、调节自噬、内质网应激等[5-7]。钠尿肽是机体调节心血管生理功能重要的内源性肽类物质，具有舒张血管、降低血压等效应[8,9]。然而，衰老和运动对心肌钠尿肽有何影响至今少有报道。本研究选取20月龄的老龄鼠作为研究对象，从钠尿肽信号角度入手，研究有氧运动对老龄小鼠心肌功能及钠尿肽信号的作用及可能的机制，探讨衰老和运动对心肌钠尿肽信号的影响，以及钠尿肽信号在运动改善老龄小鼠心脏结构和功能中的作用，以期为运动在预防衰老心肌损伤的临床应用提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用4月龄雄性C57BL/6J小鼠作为青年组，20月龄雄性C57BL/6J小鼠作为老龄组进行研究。雄性C57BL/6J小鼠购自空军军医大学实验动物中心，饲养于国际医学中心医院临床试验中心，室内温度23～25 ℃，相对湿度为40%～60%，小鼠自由饮水和摄食。随机将老龄组小鼠分为老龄组和老龄运动组。本研究动物可分为3组：青年组、老龄组和老龄运动组(aged+exercise，aged+E)，每组15只。

1.2 有氧运动训练方案

有氧运动训练采取游泳运动，首先为期1周的适应性游泳运动训练，即小鼠在第1天游泳15 min适应性训练后，游泳时间逐渐增加，在1周内累积增至60 min/d。然后进行8周的游泳运动训练，小鼠在32～35 ℃的水中进行无负重游泳运动，每天游泳60 min，5 d/周，持续运动8周。所有运动训练均在上午8∶00～11∶00进行，此过程参考课题组已经发表的相关文献[10]。

1.3 超声心动图检测小鼠心脏功能

采用连续超声Vevo 2100系统非侵入性的方法检测小鼠心功能。使用3%异氟烷麻醉小鼠，1%异氟烷维持小鼠麻醉状态，通过调整探头方向，使清晰显示出小鼠心脏的心尖部位、三腔部位、四腔部位、五腔切面及左室长轴等切面。通过手持操纵超声换能器获得2D和2D引导M模式的超声心动图，分别测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左心室收缩末内径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室舒张末内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)。

1.4 心肌组织中Caspase-3、MDA、SOD及ROS检测

取小鼠左室相同部位的心肌组织，进行裂解提取蛋白，按照购自南京建成生物公司的Caspase-3活性检测试剂盒说明书进行操作，取适量的反应液后混匀，避光37 ℃孵育4 h后，使用多功能酶标仪在405 nm处测定吸光值，计算Caspase-3活化程度。

心肌组织MDA的测定按照购自南京建成生物公司的MDA测定试剂盒进行检测，样品加入检测试剂后混匀，95 ℃水浴加热40 min后冷却，3 500 r/min离心10 min，取上清，使用多功能酶标仪在450 nm处测定吸光值，计算MDA含量。

心肌组织的蛋白提取后测定蛋白浓度，稀释蛋白后按照购自南京建成生物公司的SOD测定试剂盒说明书进行操作，按照说明书的反应体系进行配制，37 ℃孵育20 min后，使用多功能酶标仪在450 nm处测定吸光值，计算SOD含量。

心肌组织ROS的含量，按照购自南京建成生物公司的ROS测定试剂盒说明书进行操作，使用酶消化法制备心肌组织悬液，加入荧光探针后37 ℃孵育30 min离心，弃上清，使用PBS洗涤2次，离心加入PBS重悬，使用多功能酶标仪测定吸光度，激发波长为500 nm，发射波长525 nm，计算ROS水平。

1.5 血浆中ANP和BNP含量

将小鼠麻醉后，采用眼眶取血的方法进行采血，将血收集到1.5 ml离心管中，室温静置2 h或在4 ℃冰箱静置过夜后，4 ℃，1 000 r/min离心15 min，取上清，分别采用武汉优尔生生命科学有限公司生产的ANP和BNP检测试剂盒，采用酶标仪在450 nm处检测血清中ANP、BNP的含量。

1.6 Western blot检测ANP和BNP蛋白含量

提取小鼠心肌组织蛋白，按照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，在恒流250 mA，120 min的条件下，将蛋白转移到PVDF膜上后，采用5%脱脂牛奶常温封闭2 h，使用abcam公司的蛋白一抗ANP、BNP及β-actin(1 ∶1 000)在4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔的二抗(1 ∶3 000)室温孵育2 h，ECL化学发光系统检测免疫印迹。

1.7 心肌组织PKG及cGMP的活性检测

取各组小鼠左室相同部位的心肌组织，进行蛋白裂解，按照上海生工生物工程有限公司的cGMP的酶联免疫检测试剂盒说明书进行操作，配置标准品及工作液，依次加入工作液和反应终止液，采用酶标仪在450 nm处检测心肌组织中cGMP的含量。采用普洛麦格(北京)生物技术有限公司的PKG活性检测试剂盒，加入反应液，室温反应后按照说明书操作检测PKG活性。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 有氧运动对老龄小鼠心脏功能的影响

采用小动物超声仪检测小鼠左心功能，结果发现，与青年组相比，老龄组小鼠心脏的LVEF和LVFS显著降低(P<0.01)，LVESD显著增加(P<0.01)；与老龄组相比，老龄运动组心肌的LVEF和LVFS提高(P<0.05)，LVESD降低(P<0.05，见图1)。

与青年组相比，**P<0.01；与老龄组相比，#P<0.05图1 有氧运动对老龄小鼠心肌功能的影响Figure 1 Effects of aerobic exercise on myocardial function in aged mice

2.2 游泳运动对老龄小鼠心肌组织凋亡及氧化应激的影响

通过检测心肌凋亡Caspase-3和氧化应激MDA、SOD及ROS的相关指标，结果发现，与青年组相比，老龄组小鼠心肌组织Caspase-3活性显著升高(P<0.01)，氧化应激指标MDA和ROS的活性显著增加(P<0.01)，而SOD活性显著降低(P<0.01)；与老龄组相比，老龄运动组小鼠心肌组织Caspase-3、MDA和ROS的活性降低(P<0.01或P<0.05)，SOD活性提高(P<0.01，见图2)。

与青年组相比，**P<0.01；与老龄组相比，#P<0.05，##P<0.01图2 有氧运动对老龄小鼠心肌凋亡和氧化应激的影响Figure 2 Effects of aerobic exercise on myocardial apoptosis and oxidative stress in aged mice

2.3 有氧运动对老龄小鼠钠尿肽含量的影响

通过检查小鼠血浆ANP和BNP含量，结果显示，与青年组相比，老龄组小鼠血浆ANP和BNP含量增加(P<0.05)；与老龄组相比，老龄运动组小鼠血浆BNP含量降低(P<0.05，见图3)。

与青年组相比，*P<0.05；与老龄组相比，#P<0.05图3 有氧运动对老龄小鼠血浆钠尿肽的影响Figure 3 Effects of aerobic exercise on plasma natriuretic peptide in aged mice

进一步检测了小鼠心肌组织ANP和BNP蛋白表达含量，结果显示，与青年组相比，老龄组小鼠心肌ANP和BNP的表达含量增加(P<0.05)；与老龄组相比，老龄运动组小鼠心肌BNP表达含量降低(P<0.05，见图4)。

与青年组相比，*P<0.05；与老龄组相比，#P<0.05图4 有氧运动对老龄小鼠心肌钠尿肽含量的影响Figure 4 Effects of aerobic exercise on natriuretic peptide in aged mice

2.4 有氧运动对cGMP-PKG信号通路的影响

与青年组小鼠相比，老龄组小鼠心肌组织cGMP和PKG的活性显著降低(P<0.01)；与老龄组小鼠相比，老龄运动组小鼠心肌组织cGMP和PKG的活性显著提高(P<0.01或P<0.05，见图5)。

与青年组相比，**P<0.01；与老龄组相比，#P<0.05，##P<0.01图5 有氧运动对老龄小鼠心肌钠尿肽信号的影响Figure 5 Effects of aerobic exercise on natriuretic peptide signaling pathway in aged mice

3 讨论

人口老龄化是当今世界各国亟待解决的主要问题之一，尤其是我国尚处于发展中国家，人口基数大，人口老龄化问题对社会发展的影响尤为严重[11]。2019年我国60岁以上人口约为2.54亿，占总人口的17.9%，预计到2050年我国60岁以上人口将超过4亿[12]。衰老作为老龄相关性疾病发生和发展的重要危险因素，因此衰老及其相关疾病的预防和治疗已成为亟待解决的社会现实问题[13]。与衰老相关的疾病如心血管疾病、阿尔兹海默病、肌肉减少症以及骨质疏松等威胁着老龄人群的健康，使老龄人的生活质量大幅度降低，甚至对家庭以及对整个国家都造成很大的经济负担。已有文献表明，心血管疾病的危险因素(如糖尿病、高血压等)的患病率随着年龄的增长而增加，这些将导致老龄人心血管疾病的发病率不断增高[14,15]。由于衰老会增加心脏疾病的风险并降低器官功能，制定对抗心脏衰老和阐明相关机制的研究具有重要的临床意义。

ANP、BNP和CNP是目前研究较为清楚的钠尿肽成员。ANP主要由心房分泌，BNP在心房和心室均表达，但主要是由心室产生和释放[16,17]。CNP主要在内皮细胞中产生，参与血管重塑[18]。钠尿肽主要通过与他们的细胞表面膜受体结合后激活cGMP含量。cGMP信号转导的主要介质是PKG，可进一步磷酸化心血管系统中的多种细胞内蛋白质[19]。进一步发挥主要包括利尿、血管舒张、抑制醛固酮合成和肾素分泌等功能[20,21]。有报道称，长期有氧运动可增强大鼠心肌的抗氧化能力[22]，但具体机制仍不清楚。在本次研究中，结果显示老龄小鼠心脏功能显著增加，同时心肌凋亡和氧化应激增加，ANP和BNP的表达上调，cGMP-PKG的信号通路下调，提示老龄小鼠心肌损伤和心肌钠尿肽信号通路受损，可能由于衰老导致心肌钠尿肽敏感性降低，钠尿肽出现代偿性增高的表现。有氧运动可改善心肌功能，降低心肌组织凋亡和氧化应激，降低BNP含量，激活cGMP-PKG通路，表明有氧运动可减轻老龄小鼠心脏功能损伤，恢复钠尿肽信号通路。

综上所述，本研究发现老龄小鼠心肌凋亡和氧化应激增加，心肌钠尿肽信号通路受损，心脏功能受损，有氧运动可降低心肌凋亡和氧化应激，激活钠尿肽信号通路，改善老龄小鼠心脏功能。该研究从钠尿肽信号通路的角度提供了有氧运动对老龄心肌有益效应的科学实验依据。