改性乳清蛋白对凝固型酸奶品质及胆酸盐结合能力的影响

任浩杰，邓康艳，陆永存，哈传志，梅 滢，刘雅卿，吴辰乐，曹亚玲，黄 松，梅 林

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036）

随着经济、社会的不断发展，因压力及不健康的生活习惯造成的高胆固醇症已成为心血管疾病死亡的主要因素。降胆固醇药物产生的高额医疗费用和不良副作用使得人们对食品源降胆固醇产品的需求越来越迫切。现有研究发现，高胆固醇与高脂血症、动脉高血压和高血糖等有关，是引起心血管疾病的重要危险因子，已经严重影响了人类的身体健康[1]。

乳清是干酪产品在加工过程中产生的一种副产品，富含乳清蛋白（Whey protein isolate，WPI）、维生素、磷脂、乳糖及矿物质等成分[2]。其中乳清蛋白由于其重要的功能和生物学特性，近年来受到食品和保健品行业的广泛关注。很多研究学者将目标转向了乳清蛋白降胆固醇肽的制备、作用机制及应用。乳清蛋白作为一种优质蛋白，可通过对其加工改性有针对性地提高某些功能性质，通过对乳清蛋白进行改性处理能够改变其疏水基团分布、空间排列构象以及氨基酸的组成等，进而改善乳清蛋白的功能性质或开发新的功能特性[2]。1991年，Nagaoka等[3]在小鼠生物实验中发现，乳清蛋白酶解产生的活性肽在降低血液中胆固醇方面比大豆蛋白和酪蛋白更强。2001年，Nagaoka等[4]使用胰蛋白酶酶解β-Lg后分离出一种降胆固醇活性比药物（β-谷甾醇）更强的活性肽Lactostatin，并测定其氨基酸序列（Ile-Ile-Ala-Glu-Lys）。在乳清蛋白的酶解优化过程中，高学飞[5]分离纯化得到一种在抑制HMG-CoA还原酶方面表现出较强活性的乳清蛋白浓缩物（whey protein concentrate, WPC），并鉴定到发挥降胆固醇作用的是分子量介于2～12 kDa的活性肽。孙丹丹[6]在双酶水解乳清蛋白实验中，确定了最佳的酶解条件，并在动物实验中验证了所制备的活性肽具有较高的降胆固醇活性。

发酵乳制品作为一种健康食品被广泛消费，WPI可以作为功能性的添加成分来强化酸奶的主要成分，同时减少乳清分离，增加酸奶稳定性、改善口感。Remeuf等[7]发现，在酸奶中加入乳清蛋白会促进二者的高度交联，对其持水力和粘度的提高具有重要意义。Gyawali等[8]关于凝固型酸奶的研究结果，显示WPI替代对其粘度、脱水收缩作用和持水力有显著影响，并且增强了凝固型酸奶的凝胶网络结构。有研究指出[9]，在酸奶中添加低乳糖的乳清蛋白，在提高蛋白含量的同时，也可以实现不增加乳糖的含量，从而生产出适合低糖摄入者的酸奶。另外，在酸奶中加入一些具有特殊功能性的水解物，不仅可以在品质方面有所改善，而且对于乳酸菌生长和酸奶发酵有明显的促发酵作用，也能够使酸奶提供更多的关于健康方面的作用，例如抗氧化、免疫调节、防止骨质疏松等。曾羲[10]使用胰蛋白酶和碱性内切蛋白酶处理得到的大豆蛋白酶解物可以促进乳酸菌生长和酸奶发酵。李晶晶[11]在添加乳酸菌的凝固型酸奶中加入荞麦水解液，表明添加荞麦水解液的凝固型酸奶具有较强的自由基清除能力。张国柱等[12]在酸奶中加入4%的乳清蛋白酶解液，在不降低品质的基础上提高了酸奶的抗氧化性。可见，乳清蛋白可以作为功能性的添加成分，在乳制品尤其是发酵乳制品中具有良好前景。

本研究前期已利用复合改性技术获得较高降胆固醇能力WPI[13]，通过探究其结构与功能特性的关系，已初步揭示出改性WPI胆盐结合机制。但改性后WPI在应用过程中，对凝固型酸奶品质、结构、凝胶特性及胆酸盐结合能力的影响尚未清晰。因此，本研究利用酶结合有机酸改性获得的具有胆盐结合功能WPI，考察改性功能性乳清蛋白作为凝固型酸奶天然品质改良剂的应用效应，为改性降胆固醇WPI在发酵乳制品中的应用，为食品行业开发具有降胆固醇功效的食品奠定数据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳清分离蛋白（WPI，蛋白含量90%） 美国Hilmar公司；全脂奶粉 市售；植物乳杆菌FQR 保藏编号为CCTCC NO：M2 021228；酒石酸 上海振企化学试剂有限公司；DL-苹果酸（MA） 安徽雪郎生物科技股份有限公司；无水柠檬酸 潍坊英轩实业有限公司；胆酸钠（SC）、脱氧胆酸钠（SDC）、牛磺胆酸钠（STC） 上海Macklin生化科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（1500 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；Tris 北京Solarbio科技有限公司；甘氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、尿素、5,5'二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、三氯乙酸（TCA）、三（羟甲基）甲基甘氨酸、考马斯亮蓝 上海Macklin生化科技有限公司；冰乙酸 西陇化工股份有限公司；MRS肉汤 杭州Basebio技术有限公司。

BS 224 S分析电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DGT-G-C电热鼓风恒温干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；HH-S恒温水浴锅 江苏国胜实验仪器厂；WTL-10K/WTL10K微型离心机 湖南湘潭湘仪仪器有限公司；Allegra 64R高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司；Lambda 35紫外分光光度计、DSC 8000差式扫描量热仪、LS 55荧光分光光度计 美国PerkinElmer公司；Multiskan GO Thermo酶标仪 北京彭昆博远科贸发展有限责任公司；Discovery HR-1旋转流变仪 上海沃特世科技有限公司；Mastersizer 2000激光粒度仪

英国Malvern仪器有限公司；SPX-150B-Z恒温培养箱 上海博讯医疗生物仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶结合苹果酸复合改性乳清蛋白制备方法根据Mei等[13]报道的方法，配制底物浓度7%（w/v）的WPI溶液，4 ℃低温水合12 h后，用1.0 mol/L NaOH维持pH在8.0，以加酶总量为6%（w/v），胰蛋白酶：中性蛋白酶比例为4:1（m/m）分段加入。首先，在45 ℃水浴8 h进行胰蛋白酶的水解，随后通过90 ℃高温10 min灭酶来终止酶解反应，冰浴冷却至室温后，用1.0 mol/L的HCl将调节酶解液的pH至7.0；再置于50 ℃水浴2 h进行中性蛋白酶的酶解，随后通过90 ℃高温处理10 min以终止最后的酶解反应。冰浴冷却的酶解液在4500 r/min离心10 min，收集上清液酶改性乳清蛋白（WPI-E），进行第二次不同的变性处理。

苹果酸变性处理：将上述所得WPI+E上清液加入2.5%（w/v）苹果酸，混匀置于磁力搅拌器在1500 r/min条件下常温搅拌20 min。最后置于冷冻干燥机冻干，保存在4 ℃冰箱，获得酶结合苹果酸复合改性乳清蛋白（WPI-E+MA）。

1.2.2 凝固型酸奶的制作工艺 在冷却至45 ℃的热水中加入10%全脂奶粉、不同浓度的WPI-E+MA（0%、2%、4%、6%、8%）和5%白砂糖于90～95 ℃温度条件下，杀菌5 min后冷却至42 ℃，接种植物乳杆菌 FQR，接种量为2%于42 ℃发酵4 h，最后置于4 ℃冷藏后熟18 h，制成成品[14]。

1.2.3 蛋白质浓度测定 配制5 mg/mL不同浓度的发酵样品，用考马斯亮蓝试剂盒测定凝固型酸奶的蛋白质浓度。

1.2.4 持水力的测定 持水力（Water hold capacity,WHC）的测定根据李荣华[15]给出的方法进行修改。将凝固型酸奶置于室温下平衡20 min后进行测定。记录每一只离心管的质量，为M0。在离心管中放入2 mL酸奶，并称重记为M1，设置离心机的转数为10000 r/min，4 ℃离心10 min，倒掉上清液并称重，记为M2，通过公式计算凝胶的持水力，每个样品测定3次。计算公式：

式中：M0为每一只离心管的质量，mg；M1为离心管中2 mL发酵样品质量，mg；M2为去掉上清液后的质量，mg。

1.2.5 游离巯基含量、总巯基含量的测定 根据Beveridge等[16]报道的方法测定添加了WPI-E+MA的凝固型酸奶中游离巯基含量，稀释添加不同浓度WPI-E+MA的凝固型酸奶至浓度为5 mg/mL，取其0.5 mL置于离心管中，再加入2.5 mL缓冲溶液2和0.02 mL Ellman试剂混合均匀，25 ℃保温5 min，在412 nm下测定吸光值。空白以蒸馏水替代蛋白样品。

总巯基含量的测定参考Shen等[17]的方法，稀释添加了不同浓度WPI-E+MA的凝固型酸奶至浓度为5 mg/mL，取其0.2 mL置于离心管中，再加入1 mL缓冲溶液3和0.02 mLβ-巯基乙醇混合均匀，于25 ℃反应1 h，加入10 mL 12% TCA（三氯乙酸），25 ℃反应1 h，5000 r/min离心15 min，去上清，用5 mL 12% TCA悬浮，5 000 r/min离心10 min，如此2次。去上清，加入3 mL缓冲溶液2和0.03 mL Ellman试剂，5 min后使用酶标仪测定412 nm处的吸光值。计算公式：

式中：A412为412 nm处吸光值；D为凝固型酸奶样品的稀释倍数，在游离巯基中D=6.04，在总巯基中D=15.15；C为蛋白浓度，mg/mL。

1.2.6 傅里叶红外变换光谱的测定（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR） 参考Liu等[18]方法，将添加不同浓度WPI-E+MA的凝固型酸奶冻干样品与溴化钾研磨得到的粉末进行压片，并以空白溴化钾薄片为参比，采用傅里叶红外变换光谱仪进行扫描测定。扫描波数范围4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。使用OMNIC （Thermo 8.2）和PeakFit （Sea-Solve 4.12）软件对酰胺I带（1600～1700 cm-1）进行谱图的处理和曲线的分峰拟合，并计算与二级结构相对应的峰面积比例。

1.2.7 扫描电镜（Scanning electron microscopy，SEM）观察微观结构 将冻干后的添加不同浓度WPIE+MA的凝固型酸奶粉末用导电胶带固定在样品台上，并在样品表面蒸镀一层导电膜，然后采用SEM观察样品的微观形态结构，获取图像。

1.2.8 平均粒径的测定 通过激光粒度仪来测量凝固型酸奶粒径大小，设置的测量参数参考Hu等[19]的方法：将添加不同浓度WPI-E+MA的凝固型酸奶样品分散在蒸馏水中制备5%（w/v）的蛋白溶液，颗粒折射率为1.45，颗粒吸收率为0.001，分散剂为水，分散剂折射率为1.33。使用体积平均直径D（4,3）表示平均粒径。

1.2.9 流变学特性的测定 参照Hemar等[20]的方法，测试前先将各凝固型酸奶样品用玻璃棒沿同一方向缓慢搅拌，再滴至夹具内，在0.01～100 S-1的剪切速率条件下测定凝固型酸奶的静态流变学特性。

配制浓度为500 mg/mL酸奶溶液。选用直径为40 mm的平板，平行板间距为1 mm，测定温度为20 ℃，应变为10%（确保在线性粘弹范围内进行角频率的扫描），角频率ω为0.1～100 rad/s。在此条件下对凝固型酸奶的动态流变学特性进行测定分析。所得扫描结果以角频率（rad/s）为横坐标，储能模量（G'）和损耗模量（G''）为纵坐标作图。

扫描频率的条件设定为0.1～10 Hz。所得扫描结果以扫描频率（Hz）为横坐标，储能模量（G'）和损耗模量（G''）为纵坐标作图。

1.2.10 凝固型酸奶的胆酸盐结合能力测定 参考Yoshie-Stark等[21]的方法，分别取1 mL不同浓度的WPI-E+MA和1 mL不同浓度的凝固型酸奶于离心管中，再加入4 mL胆酸盐溶液（0.4 mmol/L STC、SD和SDC，PBS溶液配制），放入37 ℃培养箱中振荡2 h后，于离心机离心20 min（4000 r/min）。取2.5 mL上清液和7.5 mL H2SO4溶液（60%，v/v）混匀，70 ℃水浴保温20 min，取出后迅速放入冰水冷却，使用酶标仪测定387 nm处的吸光值，根据标曲计算溶液的胆酸盐浓度。计算公式：

式中：C0为空白对照溶液的胆酸盐浓度，mmol/L；C1为样品上清液中的胆酸盐浓度，mmol/L。

1.3 数据处理

所有实验均重复三次。使用Excel软件（Microsoft 2016）对数据进行统计处理，并使用SPSS软件（IBM SPSS Statistics 22）进行分析。方差分析采用LSD多重比较法。结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05为显著性标准。使用Origin 2019作图。

2 结果与分析

2.1 改性WPI对凝固型酸奶蛋白质浓度的影响

添加了不同浓度WPI-E+MA的凝固型酸奶，其蛋白浓度变化见表1。从表中可以看到添加WPIE+MA的酸奶蛋白浓度呈现出不同程度的降低，可能是由于WPI-E+MA对乳酸菌的促发酵作用使得乳酸菌快速生长繁殖，新陈代谢旺盛，原料奶中的蛋白质降解程度高，进而降低了凝固型酸奶蛋白浓度[22]。

表1 不同浓度的WPI-E+MA的凝固型酸奶的蛋白浓度变化Table 1 Changes of protein concentration in fermented yoghurt with different concentrations of WPI-E+MA

2.2 改性WPI对凝固型酸奶持水力的影响

酸奶的持水力是表征结构稳定性的重要指标[22]，是酸奶在高速离心后，对体系中的各种小分子物质的保持能力。图1为不同浓度的WPI-E+MA对凝固型酸奶持水力的影响。

图1 不同浓度的WPI-E+MA对凝固型酸奶持水力的影响Fig.1 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on holding water capacity of fermented yogurt

由图1可知，WPI-E+MA的添加会导致凝固型酸奶的持水力增加，并且随着WPI-E+MA添加量的增加而增大，可能是由于WPI-E+MA本身具有较强的持水力，添加至酸奶后，降低了酪蛋白与WPI的比例，在酸化过程中与酪蛋白的相互作用促进了均匀多孔结构的形成，大量的液态水被固定和截留在这种紧致均匀的蛋白质网络中，降低了乳清析出量，从而增加了凝固型酸奶的持水力[23-24]。8% WPI-E+MA添加组凝固型酸奶的持水力显著高于0%、2%、4%和6%（P＜0.05），达到最大值，为52.39%±1.42%，比未添加组（0%）提高了43.54%。8% WPI-E+MA添加组表现出的高持水力可能与胶束体系的高溶剂化和分支化的凝固型酸奶微观结构有关，在离心力的作用下，更不容易失水[25]。研究表明[7]，增加乳基中WPI的比例可以提高凝固型酸奶凝胶的水结合能力。Guzmán-González等[26]也证实了这一点，他们发现用WPI部分替代脱脂牛奶，凝固型酸奶的持水力增加了77%，比酪蛋白更具有保水性，与本文的结果一致。另外，Sodini等[27]进行了一项研究，关于乳清加工对凝固型酸奶中WPC功能的影响，用乳清中提取的WPC经低热处理强化酸奶时，酸奶的持水能力最高。Gyawali等[8]的研究结果表明，蛋白质的加工过程对乳清蛋白的功能也起着重要的作用。本文中使用的WPI-E+MA也是复合变性而来，8%添加量更利于酸奶凝胶的形成及稳定，显著提高凝固型酸奶的持水力（P＜0.05）。

2.3 改性WPI对凝固型酸奶游离巯基的影响

在发酵过程中，酸奶体系的不同会引起不同的结构变化，从而影响体系中游离巯基的改变。因此，研究了添加不同浓度的WPI-E+MA（0%、2%、4%、6%、8%）的凝固型酸奶中游离巯基的关系，如图2所示。

图2 不同浓度的WPI-E+MA对凝固型酸奶游离巯基的影响Fig.2 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on free sulfhydryl of fermented yogurt

由图2可见，随着WPI-E+MA浓度的增加，凝固型酸奶中游离巯基的含量呈现先增加后降低的趋势。对比未添加组（0%），2%添加量的酸奶游离巯基含量存在显著变化（P＜0.05），由3.51±0.04 μmol/g增加至4.47±0.12 μmol/g。这可能与WPI中成分的比例有关，之前的研究已经证明了WPI-E+MA含有一些游离巯基[13]，故增加WPI-E+MA含量也会间接提高凝固型酸奶的游离巯基含量。王月秀[28]的研究结果也表明发酵乳饮料的游离巯基含量会随着WPI添加量的增加而增加，与本文的结果一致。然而，添加更高浓度的WPI-E+MA进行发酵后，反而显著地降低了游离巯基的含量（P＜0.05），从4.47±0.12 μmol/g降低至3.28±0.01 μmol/g。出现这种变化的原因可能是WPI-E+MA自身的低pH引起的发酵体系整体pH偏低，经过乳酸菌发酵产酸后，pH更低，增加了分子间的静电斥力，导致分子稳定性改变，游离巯基转变为二硫键，酸奶中的蛋白发生聚合。孙颖[29]也发现随着pH的降低，凝固型酸奶的游离巯基也明显降低。

2.4 改性WPI对凝固型酸奶中蛋白二级结构的影响

基于酰胺Ⅰ带（1700～1600 cm-1）对不同浓度WPI-E+MA的凝固型酸奶进行分析和检测二级结构含量的变化，见表2。

由表2可以看出，β-折叠是所有凝固型酸奶蛋白二级结构的主要组成部分，从49.65%±0.53%～57.82%±0.02%。对比未添加组（0%），添加WPIE+MA的凝固型酸奶的二级结构发生了以下变化。首先，α-螺旋和β-折叠含量分别从12.96%±0.38%和51.38%±0.76%增加至19.90%±0.37%和57.82%±0.02%，β-转角含量从19.78%±0.29%下降至12.50%±0.02%，且变化显著（P＜0.05）。其中，在2%～8% WPIE+MA添加量的凝固型酸奶的α-螺旋呈现出不同程度的上升趋势，以8%添加组最显著（P＜0.05）。赵谋明等[30]关于大豆分离蛋白的酸处理研究，发现类似的α-螺旋增加的现象，与表2结果一致。并且，不同WPI-E+MA添加量的凝固型酸奶的β-折叠除2%有所降低外，其余都显示出增加的现象；同时，8%添加组的β-转角含量对比未添加组（0%）降低的最明显，表明酸性pH破坏了维持蛋白高级结构的次级键（如氢键、静电相互作用、范德华力），分子结构的疏松和伸展导致酪蛋白与乳清蛋白高度结合形成聚合物。Evangelho等[31]将β-折叠含量的增加归功于疏水区域的暴露。这可能意味着，酪蛋白与乳清蛋白结合在蛋白质表面形成的聚合物是一些具有疏水性的氨基酸组成的。从表2也可以看到，无规则卷曲结构在2%、4%、6%浓度与无添加对照组之间存在显著差异（P＜0.05），而8%添加量与无添加对照组之间不存在显著差异，说明添加量的低pH WPI-E+MA可以增加一些无规则的结构。Wang等[32]发现米糠蛋白在酸性条件下，β-转角会向无规则结构转化，与本实验的结果一致。总体来说，8%添加组β-转角向α-螺旋和β-折叠的转化意味着松散的蛋白结构重新排列成稳定有序的聚合物。

表2 不同浓度的WPI-E+MA对凝固型酸奶二级结构含量的影响Table 2 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on secondary structure content of fermented yogurt

2.5 改性WPI对凝固型酸奶微观结构的影响

酸奶的凝胶网状结构是一种立体的纤维网状，由酪蛋白的交联作用形成六棱形的空隙。因此，酸奶的微观结构与酪蛋白的交联形式密切相关。在发酵过程中，酸奶蛋白的结构和种类及其与酪蛋白的交联形式、交联程度的差异性会直接影响形成的凝胶结构的不同。以添加不同浓度的WPI-E+MA的形式强化凝固型酸奶中的蛋白含量，形成的酸奶凝胶经过冷冻干燥后使用扫描电子显微镜观察微观结构的变化。

从图3A可以看到，未添加组（0%）的微观结构与其他图像相比，呈现出完全不同的图像，蛋白质网络是一种由相对较大的球状聚集物组成的粗结构，空隙大小不一，空穴较多，酪蛋白的交联性较差。相关文献报告[33-34]，使用脱脂奶粉制成的样品中也观察到类似的大孔。Lee等[35]指出酪蛋白胶束中的交联性与酸奶凝胶的空穴孔径高度相关，并且空穴孔径越大，胶束的交联性越差。而图3B凝固型酸奶凝胶的微观结构中空隙较少，空穴的孔径也较图3A更小，说明添加2% WPI-E+MA可以增加酸奶中酪蛋白与WPI的交联度，产生更多的结构分枝，进一步提高酸奶的持水力和黏度。这一点与图2的结果一致。由图3C～图3E可知，随着WPI-E+MA添加量的增大，与酸奶中的酪蛋白的交联作用更大，交联度的增加使得凝固型酸奶凝胶的结构分支更多，网络结构更加致密，空隙更小，尤其是添加8% WPI的凝固型酸奶（图3E）。可能是因为WPI-E+MA自身的聚集体附着在酪蛋白胶束的表面，交联形成紧密的网络结构提高了酸奶的凝胶特性，使得凝胶对水分的束缚能力提高，减少乳清析出量，也进一步证明了8% WPIE+MA添加量酸奶的高持水力和聚合行为（图1、图2）。Akalin等[36]使用扫描电子显微镜在添加WPI的酸奶中观察到类似的细腻的凝胶网络结构和更多的分枝结构。Puvanenthiran等[37]在酸奶样品中获得了类似的微观结构，他们观察到，随着WPI比例的增加，网络变得更细，聚集体的尺寸变得更小，交联网络更致密，空隙更小。酸奶微观结构致密性的增加同样会导致大量游离水的固定，与本文中图1和图3E的结果一致。因此，使用某些类型的WPI会在一定程度上影响酸奶样品的微观结构。

图3 不同浓度的WPI-E+MA的凝固型酸奶的扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscopy images of fermented yoghurt with different concentrations of WPI-E+MA

2.6 改性WPI对凝固型酸奶平均粒径的影响

从上述不同添加量WPI-E+MA对凝固型酸奶游离巯基含量和微观结构影响的数据中可以看到，不同比例的WPI-E+MA对凝固型酸奶在蛋白质聚合或解离方面可以产生不同的影响。同样，蛋白质的粒径也可以反映蛋白质的聚合或解离能力。因此，为了进一步确定前面结果出现的聚集情况，测定了不同WPI-E+MA添加量的酸奶的粒径体积分布情况和平均粒径，具体结果如图4所示。

在图4A的粒径体积分布可以看到，未添加组（0%）的粒径主要分布在0.1～10 μm之间，且粒径分布呈双峰分布。而其他添加了WPI-E+MA的凝固型酸奶均呈现单峰分布，粒径范围大约在10～1000 μm。

在图4B可以看到，与未添加组（0%）相比，添加了WPI-E+MA的凝固型酸奶粒径都有着不同程度的增加。其中，2%添加组的粒径（105.86±7.86 μm）显著高于未添加组（35.05±2.63 μm）（P＜0.05），提高了66.89%。说明添加一定比例的WPI-E+MA可以提高其与酸奶中酪蛋白胶束的结合能力，进而增强乳蛋白的聚合能力。Beaulieu等[38]也做过类似的研究，发现在脱脂牛奶和WPI混合物中，粒径随着乳清蛋白比例的增加而增加。并得出一个结论，添加高水平的乳清蛋白可能导致所有k-酪蛋白与乳清蛋白结合的能力饱和，形成了乳清蛋白聚集物的颗粒。然而，添加更高浓度的WPI-E+MA进行发酵后，虽显著地降低了粒径（P＜0.05），但仍然显著高于未添加组（0%）。出现这种变化的原因可能是加入了更高浓度的WPI-E+MA使得酸奶的整体pH偏低，导致形成更小的颗粒[39]。有学者指出[40]，pH小于6.4有利于形成更小的聚集体。另外，已有报道称，增加凝胶体系中可溶性聚集体的量对形成的凝胶的机械性能有积极影响[41-42]。因此，更高含量的纳米颗粒可能有利于酸奶的最终凝胶特性，这一点在图3E也可以得到证实。

2.7 改性WPI对凝固型酸奶流变学特性的影响

凝固型酸奶是一种具有黏弹性的凝胶状物质，其流变学特性不仅与酸奶的组织结构有关，而且会随着剪切速率和频率的变化而表现出不同的流动性和形变[43]，因此常用来反映酸奶的感官品质。本文选择了不同添加量（0%、2%、4%、6%、8%）的WPI-E+MA进行发酵，考察不同WPI-E+MA添加量的凝固型酸奶之间的流变学特性的差异。

2.7.1 改性WPI对凝固型酸奶静态流变的影响图5为不同添加量（0%、2%、4%、6%、8%）的WPIE+MA对凝固型酸奶的表观黏度、剪切应力的影响。由图5A可知，在0.01～100 s-1的剪切速率范围内，随着剪切速率的增加，所有凝固型酸奶的表观黏度均下降，表现出明显的剪切变稀现象，是一种典型的非牛顿流体。并且，在相同剪切速率的条件下，可以在图5A看到凝固型酸奶凝胶的表观黏度随着WPI-E+MA添加量的增加而增大，0%添加量的表观粘度最低，2%添加量次之，8%添加量最高。其中，添加量为8% WPI-E+MA的凝固型酸奶凝胶的表观黏度最大，这可能是因为WPI-E+MA自身存在的高黏度，在发酵过程中与酪蛋白高度结合，进一步提高了凝固型酸奶凝胶的表观黏度。Remeuf等[7]发现使用WPI强化的凝固型酸奶具有较高的黏度，与本文的研究结果一致。Guinee等[44]用WPC制成的酸奶也获得了类似黏度。

图5 不同浓度的WPI-E+MA对凝固型酸奶的静态流变性能的影响Fig.5 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on static rheological properties of fermented yogurt

由图5B可知，在0.01～100 s-1的剪切速率下，所有凝固型酸奶的剪切应力都随着剪切速率的增加而增大。并且，在相同剪切速率的条件下，可以在图5B看到酸奶凝胶的剪切应力随着WPI-E+MA添加量的增加而增大。其中，添加量为8% WPIE+MA的凝固型酸奶凝胶的剪切应力最大，是因为8% WPI-E+MA凝固型酸奶凝胶的表观黏度相对较大，抗剪切能力最强，所需的剪切应力也随之增大，这与表观黏度图5A的分析结果一致。

2.7.2 改性WPI对凝固型酸奶动态流变特性的影响图6为不同添加量（0%、2%、4%、6%、8%）的WPI-E+MA对凝固型酸奶的粘弹性的影响。从图6可以看到所有酸奶凝胶的G'和G''都是随着频率的增加而呈现上升的趋势，并且在整个频率扫描的过程中，酸奶凝胶的弹性随着WPI-E+MA添加量的增加而增大，表现为：0%添加量最小，2%添加量次之，8%添加量最大；酸奶凝胶的粘性随着WPI-E+MA添加量的增加而增大，与表观黏度（图5A）的结果一致。其中，添加量为8% WPI-E+MA的酸奶凝胶的粘弹性都是最大，且粘性大于弹性，这可能是因为WPI-E+MA自身存在的高粘弹性，在发酵过程中与酪蛋白高度结合，增强了凝固型酸奶的凝胶网络结构，从而提高了凝固型酸奶凝胶的粘弹性，这一点在图3E和图4B可以得到证实。Kücükcetin等[45]、Lucey等[46]和Walstra[47]在研究中表明，以WPI为主的凝固型酸奶凝胶会产生较高的G'值，这与本文结果一致。另外，有研究指出在一定蛋白质水平下，WPI对凝固型酸奶流变学特性的影响很大程度上取决于WPI的等级[47]。Cho等[48]报道了含有高变性WPI的凝固型酸奶凝胶的弹性从13增加到80 Pa。彭新颜等[49]在猪肉糜中添加20%WPI水解物使得G'提高，这可能是由于WPI水解物中的抗氧化肽嵌于凝胶网络中，增强了凝胶强度。Massimiliano等[50]关于在香肠中添加WPI的研究发现，8%添加量可以提高其硬度和咀嚼性，且香肠的网络结构也更加紧密。推测可能是WPI或其水解物可以与蛋白发生相互作用而形成密切的凝胶结构。而本文研究的WPI-E+MA是由酶解和苹果酸复合变性产生的降胆固醇肽，由于其营养和功能特性，对变性后产生粘弹性凝胶的成胶能力也表现出显著的影响（图6）[51]。

图6 不同浓度的WPI-E+MA对凝固型酸奶的动态流变性能的影响Fig.6 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on dynamic rheological properties of fermented yogurt

2.8 改性WPI对凝固型酸奶胆酸盐结合能力的影响

之前的研究结果[13]已经证明了WPI-E+MA具有显著的胆酸盐结合能力，为了进一步研究其对凝固型酸奶胆盐结合力的影响，对添加不同浓度的WPIE+MA凝固型酸奶的胆盐结合能力进行了比较，结果见图7。

从图7A可以看到，在发酵前，随着WPI-E+MA浓度的增加，凝固型酸奶的胆酸盐结合能力都呈现出明显的上升趋势，并且对于SDC的结合能力都显著高于SC和STC（P＜0.05），说明WPI-E+MA的羟基和氨基易与SDC和SC中的氢键进行相互作用，与之前的研究结果一致。值得注意的是，8%的WPIE+MA凝固型酸奶结合胆盐的效果最显著（P＜0.05），分别为38.92%±0.84%（STC）、60.99%±1.57%（SC）、100.44%±0.45%（SDC）。

图7B展示出了不同浓度的WPI-E+MA对凝固型酸奶表现出的胆酸盐结合能力。添加不同浓度WPI-E+MA的凝固型酸奶对于STC、SC和SDC的结合能力不仅没有降低，而且较发酵前都呈现出不同程度的增加。这说明在添加WPI-E+MA的基础上进行乳酸菌发酵，可以在一定程度上提高凝固型酸奶的降胆固醇能力。而且当添加量为8%时，对STC、SC和SDC的结合能力均达到最大值，比发酵前同浓度添加量（8%）提高了59.49%、15.53%、49.2%。其中对STC的结合能力提高的幅度最大，出现这种变化的原因可能是FQR乳酸菌本身自带的生理功能和在发酵过程中产生的代谢产物-胆盐水解酶可以水解结合性胆酸盐（例如STC），使其转变为氨基酸和游离胆酸，进而降低了胆酸盐的含量，提高凝固型酸奶的降胆固醇活性[40]。另外，添加WPI-E+MA的凝固型酸奶对STC、SC和SDC的结合能力随着浓度的增加而增大，均以8%最高，与未添加组（0%）相比，分别提高了8.54%、12.14%、86.65%（图7B）。可能是由于酶解和有机酸处理的WPI-E+MA本身就具有结合胆酸盐能力而表现出降胆固醇效果，对乳酸菌的促发酵作用也使得这种结合胆酸盐的能力增强，从而提高凝固型酸奶的降胆固醇活性。因此，添加适量的具有特殊功效的WPI-E+MA进行乳酸菌发酵可以提高凝固型酸奶的功能特性。类似的研究如，张国柱等[12]添加了WPI酶解液的凝固型酸奶，抗氧化活性较空白对照组提高了11.08%。

图7 不同浓度的WPI-E+MA对凝固型酸奶胆酸盐结合率（%）Fig.7 Bile salts binding ability of different concentrations of WPI-E+MA (%)

3 讨论

凝固型酸奶在制作过程中经常会出现粘稠度低、乳清析出的不良现象，而且在贮藏和运输期间极容易受到挤压，都将严重影响其稳定性和质地，从而影响凝固型酸奶消费者的购买意愿。近年来，大量研究已经验证乳清蛋白作为添加剂添加至乳制品进行发酵的可行性，不仅可以在增强其凝胶结构上有帮助，而且具有特殊功能性质的附加价值[41]。因此，本研究利用复合酶解结合苹果酸处理WPI，得到一种具有降胆固醇性质的生物活性肽，将其添加至凝固型酸奶中，并测定其在发酵过程中的变化。

在品质上，对凝固型酸奶的持水力进行测定，结果显示WPI-E+MA的添加量与持水力呈正相关，且8%添加量组最显著（P＜0.05），其蛋白结构因WPIE+MA的加入而更稳定，研究表明WPI的比例可以提高凝固型酸奶凝胶的水结合能力，蛋白质的加工对持水力也具有重要影响[1,42]，本文使用的8% WPIE+MA是经过酶解和有机酸复合变性而来，更利于凝固型酸奶凝胶的形成。

在二级结构上，游离巯基的结果显示，随着添加量的增加，游离巯基含量先增加后减少，8%添加量组含量最少，是由于发酵引起的低pH使得分子间的静电斥力增加，游离巯基转变为二硫键，蛋白发生聚合，与孙颖[29]的结果一致。红外光谱中，β-转角含量显著降低（P＜0.05），说明低pH破坏了蛋白的次级键，分子结构变得疏松，酸奶中的酪蛋白与WPIE+MA高度结合，形成聚合物；α-螺旋和β-折叠含量显著增加（P＜0.05），说明形成的聚合物是由一些疏水性氨基酸组成[40]，且是稳定而有序的。

微观结构上发现，从SEM观察到8% WPI-E+MA与酪蛋白的交联作用增加了酸奶凝胶的分支结构，从而形成均匀紧致的网络结构，在Akalin等[36]观察到了类似的微观结构。随着添加量的增加，凝固型酸奶粒径先增加后下降，根据研究学者的解释[1]，主要是由于酸性pH更利于小颗粒的形成。在流变学特性中，添加量与表观黏度、剪切应力及粘弹性均呈正相关，余娱乐[52]报道了乳清蛋白对凝固型酸奶流变学特性的影响很大程度上取决于乳清蛋白的等级。本研究使用的WPI-E+MA是由酶解和苹果酸复合变性而来，较强的降胆固醇作用在一定程度上影响着酸奶的凝胶特性。另外，本文研究了WPIE+MA添加量对酸奶在发酵前后降胆固醇作用的影响。结果显示，在发酵前，8%添加量组结合胆酸盐效果最显著（P＜0.05）；在乳酸菌的发酵作用下，与发酵前同添加量或发酵后其他添加量相比，8%添加量组结合胆酸盐效果都是最显著的（P＜0.05），可能是由于WPI-E+MA自身的降胆固醇效果及其对乳酸菌的促发酵作用使得这种能力增强，与王丹等[53]结果类似。

另外，本文对于WPI-E+MA凝固型酸奶的功能还只是停留在体外研究阶段，当抵达体内肠胃时是否同样具有效果，需要在模拟胃肠道环境中进一步验证。

4 结论

WPI-E+MA能够较好改善凝固型酸奶的持水力、表观粘度、剪切应力与粘弹性，其中8%WPIE+MA添加量达到最优；酸奶的凝胶网状交联结构也因WPI-E+MA的加入变得更加致密、聚合度更高、粒径更大。另外，由于该改性WPI具有胆盐结合能力，在酸奶制备过程中添加该WPI，能够结合脱氧胆酸钠（SDC）、胆酸钠（SC）、牛磺胆酸钠（STC），其中SDC结合能力良好。通过上述研究证明，WPIE+MA可有效改善凝固型酸奶的品质并显著提高胆酸盐结合能力，为功能性WPI的应用推广奠定研究和数据基础。

本研究发现，改性胆盐结合乳清分离蛋白对凝固性酸奶品质及功能产生一定影响，但其对产品风味及消化特性仍未深入研究，下一步拟通过体外模拟消化实验进一步探讨以功能性乳清分离蛋白添加制备的凝固型酸奶消化特性。