基于网络药理学和分子对接探讨常见酚酸提高机体免疫力的作用机制

张宇欣，刘魏魏，杨 娟，周炜炜，戴小枫，李秀梅, ，郑 威

（1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨 150076；2.农业农村部饲料生物技术重点实验室，中国农业科学院饲料研究所，北京 100081）

免疫系统是抵御外来物质或有害物质侵袭的第一道防线，包括先天免疫和适应性免疫，二者协作发挥免疫防御作用保障机体的健康[1]。近年来由于环境污染加重、生活压力加大、运动量降低、饮食不规律等原因，导致免疫力下降的人群逐年增多，免疫力低下成为常态。机体免疫功能下降会导致许多疾病的产生，如骨质疏松[2]、风湿[3]、支气管哮喘[4]、炎症性肠病[5]等，提高机体免疫力是一种很重要的预防疾病的手段，研究和开发提高免疫力的药物或保健品具有重要意义。酚酸（phenolic acids）是指含有酚环的有机酸化合物[6]。酚酸的来源广泛，不仅在植物中含量丰富，在藻类及微生物中也有发现[7-8]。酚酸根据骨架结构不同可分为两类：苯甲酸类和肉桂酸类。常见的苯甲酸类主要包括原儿茶酸、藜芦酸、没食子酸等；肉桂酸类主要包括肉桂酸、芥子酸、对香豆酸等[9]。还有部分酚酸是简单酚酸的衍生物，不在此分类范围，如绿原酸和鞣花酸[10]。

大量研究表明酚酸具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗病毒、提高免疫力等多种药理活性。然而，关于酚酸类化合物提高免疫力的研究和报道却比较少。如，咖啡酸可以增强小鼠巨噬细胞的溶酶体活性，阿魏酸和对香豆酸明显促进了LPS诱导的B细胞的增殖[11]，对香豆酸处理大鼠后，大鼠血清中免疫球蛋白含量显著升高，吞噬指数降低，迟发性超敏反应引起的炎症显著减少[12]，绿原酸可以增加断奶仔猪血清中的IgG，促进B细胞及T细胞的增殖[13]。尽管已有研究报道了酚酸类化合物的提高免疫力作用，但酚酸化合物提高免疫力作用机制的研究尚未揭示清楚，在一定程度上限制了酚酸类化合物的应用。

网络药理学是以多学科为基础，运用多门技术从整体角度阐释药物治疗疾病的机制、疾病的发展过程的分析手段[14]，系统的揭示了“药物-靶点-疾病-通路”之间复杂的网络关系，被广泛的应用于机制研究中。目前，已有研究采用网络药理学研究中草药提高机体免疫力的作用机制[15]，因此本文拟通过网络药理学方法对常见酚酸的免疫增强作用进行挖掘及机理研究，以期为后续酚酸类化合在免疫活性方面的深入研究和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 常见酚酸类化合物及其靶点的收集

通过中国知网、PubMed、Web of Science查阅相关文献，收集有提高免疫力功效的常见酚酸类化合物，采用TCMSP数据库（https://www.tcmsp-e.com/）、STITCH数据库（http://stitch.embl.de/）以及SwissTargetPrediction在线靶点筛选平台（http://swisstargetprediction.ch/）收集这些酚酸的靶点，将结果整合去重。利用Cytoscape3.8.0软件构建常见酚酸类化合物-靶点网络图。

1.2 提高免疫力相关靶点筛选

以“immunity”、“boost immunity”为检索词，在GeneCard数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）检索提高免疫力的相关靶点，将结果整合去重，得到提高免疫力相关靶点。

1.3 常见酚酸类化合物与提高免疫力蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

利用Venny2.0.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将常见酚酸类化合物靶点与提高机体免疫力靶点取交集，将交集靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）进行PPI网络构建，限定研究物种为“人”（“Homo sapiens”），最低互作评分设置为“最高置信度”（highest confidence（0.900）），得到常见酚酸类化合物作用于提高机体免疫力靶点的 PPI 网络。将PPI结果数据导入Cytoscape3.8.0软件作进一步分析。以degree、betweenness centrality、closeness centrality为参考依据，筛选得到核心靶点。

1.4 富集通路分析

将核心靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/），分别选择生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cell component，CC）进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能分析，选择京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）进行通路富集分析，分析结果以伪发现率（false discovery rate，FDR）＜0.01，P值＜0.01进行筛选，P值越小表明结果越显著。得到常见酚酸类化合物提高机体免疫力的主要生物过程及主要信号通路，并将结果进行可视化。

1.5 分子对接

分别在TCMSP数据库和PCSD PDB数据库（https://www.rcsb.org/）搜索下载小分子化合物和蛋白质的3D结构，将其分别导入PyMOL软件进行去水及加氢，导出为pdb格式，将pdb文件导入Auto Dock软件靶蛋白选为受体，小分子选为配体并设置扭转键后导出为pdbqt格式文件。将两个文件重新导入Auto Dock软件设置对接参数，运行Autodockvina进行对接，选取结合能最低的构象为最优构象。采用PyMOL软件对结果进行可视化。

2 结果与分析

2.1 常见酚酸类化合物收集

在中国知网、PubMed及Web of science数据库中搜索具有提高机体免疫力的常见酚酸类化合物，得到共计36个酚酸类化合物（表1），收集靶点共计496个，通过Cytoscape3.8.0软件对上述酚酸类化合物及靶点进行网络关系构建（图1）和分析。按照degree值从高到低的顺序进行排序（表2），其中，连接靶点最多的为咖啡酸苯乙酯（Caffeic acid phenethyl ester），degree值为106，其次为阿魏酸乙酯（Ethyl ferulate），其degree值为100。

表2 常见酚酸类化合物Degree值排序Table 2 Order of degree value of common phenolic acids

图1 常见酚酸类成分-靶点网络图Fig.1 Component - target network of common phenolic acids

表1 常见酚酸类化学成分信息Table 1 Information on chemical constituents of common phenolic acids

2.2 蛋白互作网络（PPI）构建

通过GeneCard数据库和OMIM数据库收集免疫相关靶点共计16691个。利用Venny2.0.1将常见酚酸类化合物靶点与提高机体免疫力靶点取交集，得到常见酚酸提高免疫力的潜在作用靶点共454个（图2）。

图2 常见酚酸与提高免疫力靶点Venn图Fig.2 Venn diagram of common phenolic acid for enhancing immune function

将常见酚酸调节免疫的潜在作用靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析（图3），得到358个靶点，1633条边，平均度值为7.21。

图3 常见酚酸提高免疫力蛋白互作网络图Fig.3 Protein-protein interaction of common phenolic acid for enhancing immune function

将PPI结果导入Cytoscape3.8.0进行分析，依据degree值、betweenness centrality、closeness centrality进行筛选，取每项均高于平均值的靶点，筛选得到34个核心靶点（表3），绘制出常见酚酸类化合物提高机体免疫力关键靶点网络图（图4）。图中包括34个靶点，190条边，节点越大、节点颜色越深代表该靶点在网络中越重要，由此可见SRC、MAPK1、HSP90AA1、AKT1、TP53、STAT3、JUN、RELA在酚酸类化合物提高机体免疫力的过程中发挥重要作用。

图4 常见酚酸类化合物提高机体免疫力的核心靶点网络图Fig.4 Core target network of common phenolic acid for enhancing immune function

表3 常见酚酸类化合物提高机体免疫力的核心靶点Table 3 Core targets of common phenolic acid for enhancing immune function

续表 3

2.3 GO功能分析及KEGG通路富集

将核心靶点导入DAVID数据库进行GO分析及KEGG分析。得到GO条目100条（FDR＜0.01，P＜0.01），其中BP条目58条，CC条目9条，MF条目33条。将各个条目基因数排名前15的条目进行可视化（图5）。结果显示，这些靶点主要涉及正调控RNA聚合酶II启动子转录（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、转录的正调控，DNA模板化（positive regulation of transcription, DNA-templated）、凋亡过程的负调节（negative regulation of apoptotic process）等生物过程，且主要在核（nucleus）、细胞质基质（cytosol）、核质（nucleoplasm）等部位通过蛋白结合（protein binding）、酶结合（enzyme binding）、相同蛋白质结合（identical protein binding）等方式对生物过程进行调节。

图5 常见酚酸提高免疫力核心靶点的GO基因功能富集分析Fig.5 Go enrichment analysis of core targets of common phenolic acid for enhancing immune function

KEGG富集分析得到120条通路（FDR＜0.01，P＜0.01）。列出基因数量排名前20的通路（表4），并将分析结果可视化（图6）。结果表明，常见酚酸类化合物提高机体免疫力主要涉及癌症通路（Pathways in cancer）、多聚糖肿瘤通路（Proteoglycans in cancer）、丙型肝炎（Hepatitis C）、乙型肝炎（Hepatitis B）、甲状腺激素信号通路（Thyroid hormone signaling pathway）等多条通路，其中与免疫直接有关的通路包括MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、PI3KAkt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、FcεRI信号通路（Fc epsilon RI signaling pathway）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）等。用Cytoscape3.8.0软件绘制核心靶点-成分-通路网络图（图7），图中包含85个节点，360条边，图中一个成分可对应多个靶点，一个靶点可对应多条通络，可见酚酸通过多途径、多靶点起作用。

图6 常见酚酸提高免疫力核心靶点KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway analysis of core targets of common phenolic acid for enhancing immune function

图7 核心靶点-成分-通路网络图Fig.7 Core target-component-pathway network

表4 常见酚酸提高免疫力核心靶点KEGG通路富集分析结果Table 4 KEGG pathway analysis of core targets of common phenolic acid for enhancing immune function

2.4 分子对接

采用AutoDock软件对结果进行分子对接验证，蛋白质选取核心靶点中degree值为前5的靶点，分别为SRC（PDB ID:4hxj）、MAPK1（PDB ID:7nr8）、HSP90AA1（PDB ID: 7kw7）、AKT1（PDB ID:1unq）、TP53（PDB ID:2k8f），小分子选取核心靶点-成分-通路网络中Degree值排名前5的化合物，分别为迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、鞣花酸、阿魏酸乙酯、芥子酸。以结合能为筛选条件，结合能越低结合构象越稳定（表5），结合能小于-5.0 kcal/mol，说明分子对接结果良好。将各靶点中结合能最低的结果运用PyMOL软件进行可视化（图8）。

图8 关键靶点与关键成分分子对接模式图Fig.8 Molecular docking pattern of key component and key targets

表5 关键靶点与关键成分的分子对接结合能（kcal/mol）Table 5 Binding energy of key component and key targets (kcal/mol)

3 讨论与结论

免疫系统是维持机体健康的重要防线，免疫系统功能下降会导致各种疾病的产生，提高免疫系统功能可以抵御外来病原微生物入侵、清除体内有害成分、突变及衰老细胞，从而达到维持机体健康，避免疾病的目的。本研究运用网络药理学的方法对常见酚酸类化合物提高机体免疫力的作用靶点及作用机制进行了系统分析。

分析结果表明，常见酚酸类化合物提高机体免疫力的核心靶点有34个，其作用机制主要涉及SRC、MAPK1、HSP90AA1、AKT1、TP53、STAT3、JUN、RELA等多个靶点。SRC属于非受体酪氨酸激酶家族，是膜受体与细胞质信号转导机制的重要纽带，通过参与TBK1介导的IFN1通路、IL-33介导的DUOX1通路启动先天性免疫应答[16-17]。MAPK是一类进化保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，MAPK级联反应在先天免疫中起重要作用[18]，有研究表明MAPK1可以介导T、B细胞的生长分化，通过调节体液免疫和细胞免疫提高机体免疫能力[19]。HSP90AA1是热休克蛋白的核心成员之一，具有极强的免疫应答效应，自然界中的致病菌可刺激机体产生HSP90AA1，诱导细胞自噬，可以有效的控制早期感染[20]。AKT1是调节免疫、降低炎症反应、抗癌的关键靶点，有研究发现，AKT1基因敲除的小鼠其巨噬细胞偏向于致炎的M1型极化[21]，而激活AKT1会导致巨噬细胞偏向于抗炎的M2型极化[22]，M2型巨噬细胞有着强大的免疫调节及抗炎作用[23]。TP53是一种抑癌基因，起到控制细胞周期的作用[24]，同时参与了DNA修复机制，对于内源或外源因素导致的DNA损伤起修复作用，在免疫调节过程中起重要作用[25]。STAT3一种转录调节因子，在发育或成熟的组织中起到调节免疫及炎症反应的作用[26]，研究表明，STAT3可以在病原菌入侵时可迅速增加中性粒细胞的供应，启动先天免疫来控制感染[27]。JUN参与了免疫细胞的增殖与分化，有研究表明，抑制JUN信号通路可明显降低炎症浸润小鼠血浆中炎症因子的表达量[28]。RELA是NF-κB家族的重要成员，静息状态下，RELA与IκB结合，受到刺激时I-κB降解激活RELA发挥转录调节作用，调控NF-κB下游靶基因[29]。

由核心靶点-成分-通路网络中可知，核心靶点对应成分有31个，其中连接核心靶点数量较多的成分分别为迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、鞣花酸、阿魏酸乙酯、芥子酸。细胞凋亡是控制免疫反应的一种方式，免疫抑制剂可以通过诱导免疫细胞凋亡来抑制有害的免疫反应，迷迭香酸可以作为免疫抑制剂调控T淋巴细胞和NK细胞的非正常增殖，对机体免疫系统起到调节作用[30]。梁正敏等[31]研究表明，迷迭香酸可以显著下调IL-4水平的升高，显著上调IFN-γ水平的降低，明显改善卵清蛋白引发的哮喘及免疫调节失衡。迷迭香酸甲酯在体外免疫实验中表现出良好的免疫抑制活性，研究表明，迷迭香酸甲酯可通过抑制IL-2的产生来抑制T细胞的增殖[32]，然而其抑制IL-2的产生机制还需进一步探索。鞣花酸是一种天然的免疫调节剂，可以抑制脂多糖（LPS）诱导的树突状细胞中共刺激分子的表达，阻断LPS诱导的JNK的激活，使促炎因子IL-12和IFN-γ表达减少，通过调节LPS对树突状细胞的影响来调节免疫[33]。阿魏酸乙酯作为阿魏酸的衍生物之一具有广泛的药理作用与生物活性，由于其脂溶性较阿魏酸高，其进入细胞膜的能力强，药效也随之增强。有研究表明，阿魏酸乙酯可以通过激活 AMPK/Nrf2信号通路来缓解脂多糖诱导的急性肺损伤，并抑制了促炎因子的表达[34]。芥子酸可通过抑制巨噬细胞内NF-κB的活性来调节炎症及免疫反应[35]，同时芥子酸还具有很高的抗氧化及抗菌活性，且其抑制食源性致病菌的同时不会对乳酸菌产生影响[36]。

酚酸类化合物调节免疫的能力可能与其抗氧化能力和抗炎能力有关[37]，酚酸类成分具有特定的酚羟基，这种空间结构是影响生物活性的关键因素[38]。据报道，化合物影响免疫系统功能主要是因为其结构中含有羟基，影响了酶或电子的传递[11]。酚羟基中和自由基后失去一个氢形成稳定的半醌式结构和稳定的自由基，从而终止链式反应[38]，同时，羟基作为强供电子基团可以显著增强酚酸类化合物的抗氧化活性，当苯环上的羟基数量小于4时，其抗氧化能力与可以形成氢键的羟基数量成正相关[39]。Nakamura等[40]通过化学结构研究证明迷迭香酸中抗氧化的结构基础是邻二酚羟基，迷迭香酸是邻二酚羟基化合物的二聚体，这表明RoA可能比简单的酚类药物具有更大的自由基清除作用，且C3位的共轭双键对其具有增效作用。Yuan等[41]研究表明，迷迭香酸甲酯中的羰基可以螯合金属基质酶-1（MMP-1）中的锌离子形成配位键，另一个羰基与氮原子形成离子键，末端的两个酚羟基与酶的疏水结构域形成氢键，迷迭香酸甲酯与MMP-1的高亲和度导致了酶的失活从而影响一系列的病理过程。众所周知，羟基的数量和位置可能会显著影响多酚的抗氧化活性[42]，所以在相同条件下，由于二聚体鞣花单宁中羟基更丰富，会表现出比单体鞣花单宁更高的抗氧化活性[43]。但鞣花酸在鞣链单宁抗氧化能力测试中显示出最有效的ABTS清除活性[43]，尽管鞣花酸的羟基比二聚体和单体鞣花单宁少，这种现象可能是由于鞣花酸的分子量较低，降低了空间位阻并提高了其灵活性。阿魏酸乙酯酚羟基的邻位有甲氧基结构，形成分子内氢键，所以氢原子与自由基结合能力降低，其抗氧化能力有限[44]，阿魏酸乙酯清除自由基能力低于阿魏酸，但乙基酯化降低了阿魏酸乙酯的极性，表现出较高的亲脂性，促进该化合物在细胞膜上的运输，可使其进入细胞发挥作用[45]。芥子酸在酚羟基的邻位位置具有两个甲氧基，两个强供电子基团使氢原子更容易被自由基获取，所以芥子酸是单体结构中最有效的抗氧化剂[46]。

为进一步了解核心靶点的功能及作用通路，对34个核心靶点进行GO功能富集及KEGG通路富集分析，GO分析结果显示，常见酚酸类成分主要调控RNA聚合酶II启动子转录正调节、转录的正调控，DNA模板化、凋亡过程的负调节、RNA聚合酶II启动子转录的负调控等方面。KEGG通路富集分析结果显示，常见酚酸类化合物提高机体免疫力主要涉及癌症通路、多聚糖肿瘤通路、丙型肝炎、乙型肝炎、甲状腺激素信号通路、EB病毒感染通路、病毒致癌作用、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、催乳素信号通路等多条信号通路，说明酚酸类化合物通过调节多条通络发挥调节机体免疫力的作用。

网络药理学结果显示，迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、鞣花酸、阿魏酸乙酯、芥子酸在核心靶点-成分-通路网络中degree值较高，因此将五种化合物与核心靶点排名前五的靶点SRC、MAPK1、HSP90AA1、AKT1、TP53进行分子对接，结果显示其结合能大部分小于-5 kcal/mol，说明常见酚酸的关键成分与核心靶点蛋白结合稳定。

综上所述，本研究应用网络药理学方法预测了常见酚酸类化合物提高机体免疫力的关键成分、作用靶点，其关键成分有迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、鞣花酸、阿魏酸乙酯、芥子酸，核心靶点有SRC、MAPK1、HSP90AA1、AKT1、TP53、STAT3、JUN、RELA等，其作用机制在于通过癌症通路、多聚糖肿瘤通路、丙型肝炎、乙型肝炎、MAPK信号通路等多条通路调节机体免疫力，下一步需要对分析得到的酚酸、靶点及通路进行实验验证，为进一步研究及临床应用提供理论基础。