基于UPLC-Q/TOF-MS/MS和生物信息学探讨铁棍山药皮中化学成分的药用和营养价值

安 莉，汪 红，马婧玮，袁永亮，翟南南，郑鹭飞，吴绪金,

（1.河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，河南郑州 450002；2.郑州大学第一附属医院药学部，河南郑州 450052；3.SCIEX中国，北京 100015；4.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

铁棍山药（Dioscorea oppositeThunb. cv. Tiegun）为薯蓣科植物薯蓣的块茎，分布于河南省武陟县、温县等地的山药品种，其性平味甘，健脾止泻、补肺益肾，具有“补虚羸、除寒邪热、补中益气力、长肌肉、久服耳目聪明、轻身不饥、延年”等功效，属山药中的极品[1]。铁棍山药富含多糖、蛋白、脂类、黄酮、多酚类等多种活性成分，具有调节脾胃、增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等作用，兼有食用价值和药用价值[2-3]。

除了铁棍山药的药用饮片外，目前市场上也不断涌现出以铁棍山药为原料制成的零食或保健品，如铁棍山药薯片、铁棍山药饼干、铁棍山药粉等。然而，无论是在直接食用或加工铁棍山药过程中，铁棍山药皮一般都直接削除丢弃，造成了极大的资源浪费。目前，关于铁棍山药皮的报道尚少，仅见对其所含部分成分的研究，如多糖[4]、黄酮类化合物的提取[5]以及多酚化合物的体外抗氧化作用[6]。这些研究仅关注单类化合物，对其所含化学成分的认识不够全面，无法反映其整体的化学成分特征。此外，铁棍山药皮药用和营养价值尚不明确，这也严重阻碍了其再利用。因此，全面、系统识别铁棍山药皮所含的化学成分，并挖掘其相应的分子机制，对于铁棍山药皮活性功能物质的开发应用具有重要的指导意义。

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q/TOF-MS/MS）具有速度快、灵敏度高、分辨率高等特点[7]，根据化合物质谱信息，结合相关数据库，能够对中草药、复方制剂、天然产物等中的化学成分进行快速分离和鉴定。生物信息学是综合运用系统生物学、计算机科学、信息技术和数学理论等技术方法的交叉学科[8]，能够从中草药、复方制剂、天然产物机制研究、复杂疾病治疗等生命科学的海量数据中，发现、挖掘、阐述其中所包含生物学意义[9]。

联合UPLC-Q/TOF-MS/MS和生物信息学的方法越来越多地应用于多成分多靶点多通路的机制研究[10-11]。本研究拟采用UPLC-Q/TOF-MS/MS技术结合质谱数据库对铁棍山药皮中的化学成分进行定性识别，并在此基础上，利用生物信息学对其潜在的靶点进行预测和功能分析，探讨铁棍山药皮化合物成分的药用和营养价值，为铁棍山药皮的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山药皮 河南省温县铁棍山药的山药皮；甲醇、乙腈 色谱级，美国EMD Millipore公司；甲酸 色谱级，美国Sigma公司。

Exion 20AD型超高效液相色谱仪、X500R QTOF型高分辨质谱仪（SCIEX OS软件） 美国SCIEX公司；ME204E电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q Synthesis 超纯水系统 美国Millipore公司；DW-HL398S超低温冷藏冰箱 中科美菱低温科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 将铁棍山药流水清洗干净，晾干，削皮后即刻将皮置于-80 ℃环境中过夜冷冻，取出后迅速于冷冻干燥机内-90 ℃真空低温冷冻干燥，待完全干燥后制成铁棍山药皮冻干粉，过8号筛。称取1.0 g，加入5 mL甲醇:水=1:1（v/v）超声提取30 min，在10000 r/min的条件下离心10 min，吸取上清液进样[12]。

1.2.2 色谱条件 Waters HSS T3色谱柱（100×3.0 mm，1.8 μm）；流动相：0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序为：0～1.0 min，3% B；1.0～10 min，3%～30% B；10～20 min，30%～99% B；20～26 min，99% B；26～26.1 min，99%～3% B；26.1～30 min，3% B。进样盘温度：15 ℃；流速：0.40 mL/min；柱温：40 ℃。

1.2.3 质谱条件 质谱采用电喷雾离子源ESI检测，在正、负离子模式下进行样品采集，开启动态背景以扣除干扰。相关参数设置为：气帘气流（CUR）25 psi；雾化气流速（GS1）50 psi；辅助气流速（GS2）50 psi；离子源电压（ISVF）5500/-4500 V；离子源温度（TEM）500 ℃；捕获电压（DP）80 V；碰撞电压（CE）35±15 V。一级质谱m/z扫描范围设为50～1300 Da，扫描累计时间0.25 s，选择响应最高的碎片进行二级扫描，m/z扫描范围设为50～1000 Da，扫描累计时间0.1 s。

1.2.4 化合物鉴定 采用SCIEX OS软件进行质谱原始数据的采集和处理，通过质量准确度、同位素丰度、二级谱库确认及保留时间等，根据SCIEX自建天然产物数据库SCIEX TCM Library自动进行峰提取和筛查，进一步根据获得的质谱信息结合参考文献、有机小分子生物活性数据库（PubChem: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[13]、人类代谢组数据库（HMDB：https://hmdb.ca/）[14]和植物活性分子数据库（Collective Molecular Activities of Useful Plants:CMAUP）[15]进行铁棍山药皮中化合物的鉴定识别。

1.2.5 活性成分筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）将所鉴别的化合物成分进行口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和药物相似度（drug-likeness，DL）的查找。根据TCMSP数据库分析平台筛选标准[16]OB≥20%和DL≥0.1筛选出潜在活性成分。

1.2.6 铁棍山药皮-化合物-靶点网络构建 将筛选出的活性成分利用PubChem数据库找到相应的SMILES信 息，通 过SwissTargetPrediction数 据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），设定物种“Homo sapiens”进行检索，选择Probability值大于0的值，获取其潜在的作用靶标[17]，利用Cytoscape 3.8.2分析软件构建铁棍山药皮-化合物-靶点相互关系网络。

1.2.7 潜在作用靶点功能富集分析 将1.2.6项下获得的作用靶点，通过R软件中的ClusterProfiler软件包进行相关靶点的KEGG通路分析[18]，以P＜0.05为筛选条件，获得铁棍山药皮中目标化合物富集的相关通路，进而分析其药理和营养作用机理。

2 结果与分析

2.1 基于UPLC-Q/TOF-MS/MS平台的铁棍山药皮中化学成分识别

采用上述色谱和质谱条件对铁棍山药皮提取物中的化学成分进行检测，其正、负离子模式扫描下质谱基峰离子流图如图1所示。利用SCIEX OS软件拟合计算可能的分子式，结合本地SCIEX TCM Library数据库对铁棍山药皮质谱离子流图匹配出的化合物进行前期推测，再根据参考文献、CMAUP、PubChem、HMDB等数据库提供的一级、二级离子信息等进行进一步确定，最终鉴别出33种化合物，其中酚酸类9种，黄酮类7种，氨基酸有机酸类5种，糖类2种及其他类10种，以上成分相关归属及鉴定信息见表1。

图1 铁棍山药皮提取物在正离子模式和负离子模式下的基峰离子流图Fig.1 Base peak intensity chromatograms of Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel in positive and negative modes

表1 铁棍山药皮提取物中化学成分的鉴定Table 1 Identification of chemical composition of Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel

2.2 活性成分筛选

将铁棍山药皮中鉴别所获得的化合物成分，根据TCMSP数据库分析平台筛选标准OB≥20%和DL≥0.1筛选出潜在活性成分10个，见表2。

表2 铁棍山药皮中通过OB和DL预测的10个活性成分Table 2 Ten active ingredients predicted by OB and DL in Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel

2.3 潜在作用靶标预测和网络构建

进一步通过SwissTargetPrediction数据库对获得的10个化合物靶点进行预测，去掉重复基因名称，共获得348个潜在作用靶点。利用Cytoscape 3.8.2软件构建出铁棍山药皮-化合物-靶点网络，见图2。

图2 铁棍山药皮-化合物-靶点网络Fig.2 Network of Dioscorea opposita Thumb peel-compound-target network

网络中连接度值表明此化合物或靶点的重要程度，化合物的连接度分析发现，10个化合物中芹菜素、金合欢素、甘草素、山药素I、原花青素B1、腺苷、双去甲基姜黄素和丁香酸葡萄糖苷这8个化合物的连接度值均在60以上，其中芹菜素、金合欢素和甘草素的连接度值均大于100（图3A），上述化合物可能为铁棍山药皮中潜在发挥功效的重要化合物；碳酸酐酶2（CA2）、丝/苏氨酸蛋白激酶Pim-1（PIM1）、二肽基肽酶4（DPP4）、环加氧酶1（PTGS1）、碳酸酐酶9（CA9）、碳酸酐酶1（CA1）、雌激素受体α（ESR1）、环加氧酶 2（PTGS2）、糖原合成酶激酶3β（GSK3B）和蛋白质酪氨酸磷酸1（PTPN1）为连接度排名前10的作用靶点（图3B），其可能为铁棍山药皮作用的主要靶点。

图3 网络中重要化合物靶点数和作用的主要靶点Fig.3 Top ten important compounds and primary targets of the network

续表 1

2.4 潜在作用靶点KEGG功能富集分析

将获得的潜在作用靶基因通过R软件中的ClusterProfiler软件包进行KEGG功能富集分析，其中富集程度最高且排名前10条重要代谢通路分别为：PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、脂质和动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、癌症蛋白多糖信号通路（Proteoglycans in cancer）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、前列腺癌（Prostate cancer）、内分泌抵抗（Endocrine resistance）、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用信号通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、非小细胞肺癌通路（Non-small cell lung cancer）和胰腺癌通路（Pancreatic cancer），见图4。

图4 化合物靶点的KEGG通路分析（Top10）Fig.4 KEGG pathway analysis of compound targets （Top10）

KEGG通路富集分析显示，铁棍山药皮活性成分对应的通路主要集中在细胞信号通路、癌症和代谢类疾病治疗等方面。其中，在细胞信号通路上，分别有48和34个基因富集在PI3K-Akt信号通路和HIF-1信号通路；抗癌症方面，分别有38、32、25、24和23个基因富集在癌症蛋白多糖信号通路、前列腺癌通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、非小细胞肺癌通路和胰腺癌通路等通路上面；调节代谢系统方面，分别41、25和29个基因富集在脂质和动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用信号通路和内分泌抵抗通路。图5展示了这些KEGG通路与靶基因之间的相互关系。

图5 KEGG通路与靶基因相互关系网络Fig.5 KEGG pathway and target gene correlation network

3 讨论与结论

针对铁棍山药中化合物成分及其药理活性的研究较多，相对而言，铁棍山药皮的相关研究报道较少[4-6]。本文利用UPLC-Q/TOF-MS/MS平台，分析并鉴别出了铁棍山药皮中的33种化合物，为其成分的识别和潜在价值奠定了前期基础；通过生物信息学分析方法，找出铁棍山药皮中发挥功效的关键化学成分，其中芹菜素、金合欢素、甘草素、去二甲氧基姜黄素、山药素I等物质具有良好的生物活性。如芹菜素具有抗炎、抗肿瘤侵袭和转移、保护肝功能、抗动脉硬化和脑血栓、降压和镇静抗焦虑等功效[29]，金

合欢素具有抗肿瘤、免疫调节、保护心脏和神经系统等多种药理活性[30]，甘草素具有良好的抗癌活性和抗肿瘤作用[31]，去二甲氧基姜黄素具有抗细胞凋亡、抗氧化和抗炎作用[32]，山药素I具有良好的抗炎作用[33]，由此可见，铁棍山药皮可能通过多成分共同发挥其药用和营养价值。同时，这些功能成分的鉴别对于铁棍山药皮中营养与药用功能物质的开发和利用也有着重要的参考意义。

铁棍山药皮-化合物-靶点网络研究发现，铁棍山药皮具有多个作用靶点，其中重要潜在靶点包括癌症肿瘤相关基因（PIM1）、治疗糖尿病代谢相关基因（GSK3B、PTPN1、DPP4）、雌激素受体（ESR1）、环加氧酶（PTGS1、PTGS2）和多种碳酸酐酶（CA2、CA9、CA1）等，这些基因与癌症肿瘤、糖尿病、细胞内信号传导、细胞生长和增殖调控及代谢等密切相关，体现了铁棍山药皮多成分-多靶点系统调节的作用机制。研究将成分对应的靶基因进行KEGG富集分析，明确了铁棍山药皮成分靶点对应的疾病主要集中在肿瘤癌症、细胞信号传导、糖尿病及代谢类等相关途径，这一发现也为药物的进一步研发提供了科学依据。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS/MS分析技术进行了铁棍山药皮中化学成分的鉴别，通过生物信息学预测了潜在活性化合物具有的多种药理活性，初步明确了铁棍山药皮具有的药用和营养价值，但铁棍山药皮尚需进一步深入挖掘和研究。首先，对铁棍山药皮中化合物成分的提取工艺、定性和定量分析研究十分必要；其次，本文通过生物信息学技术建立的山药皮-化合物-靶点网络中，所涉及的重要化合物和重要靶点需深入研究；最后，铁棍山药皮的再利用过程，需要建立规范化流程，进而可以形成产品，有望作为保健品或者中医药产品应用于人类疾病的预防和治疗。由此可见，本研究为铁棍山药皮资源的有效利用提供了物质基础和开发依据，也为进一步延长铁棍山药的产业链、提高其附加值提供了理论数据。