响应面法结合模糊数学优化复合枣醋醋酸发酵工艺

王晓婧,杨倩,白博涛,赵泉

(山西工商学院，太原 030006)

壶瓶枣是山西省太谷县的一大特色农产品,枣肉中的类黄酮、总酚等含量十分高[1]。壶瓶枣含糖量高,还原糖含量接近总糖含量的75%,可以很好地被酵母菌等发酵微生物利用[2]。由于壶瓶枣成熟后容易落果,雨天出现大量裂枣,不利于运输储存,造成很多浪费而影响收入,裂枣的开发利用成为研究热点[3]。山西吕梁的沙棘占地面积广,沙棘是一种落叶灌木或小树[4],沙棘果实营养物质丰富,氨基酸是鹿茸的5倍；多酚类化合物是人参的4倍；维生素含量最高,是苹果的200多倍,被称为“VC之王”[5-6]。

壶瓶枣含糖量高,有利于酵母菌发酵,不需要添加糖类也可以达到发酵所需的糖度[7],而沙棘含糖量低,有机酸高,难以单独发酵[8],因此可以将沙棘加入到枣浆中调节pH,将两者的优点集中在一起,进行酵母菌和乳酸菌混菌发酵后,进一步进行醋酸发酵,酿制成壶瓶枣沙棘复合果醋。

本试验以壶瓶枣和沙棘为原料,通过酶解、酵母菌和乳酸菌混合酒精发酵以及醋酸发酵,制作出一款新型的壶瓶枣沙棘复合枣醋,该枣醋不仅具有壶瓶枣和沙棘果实的营养,还具有果醋的功能。在单因素试验的基础上,通过模糊数学法对枣醋进行较为客观的评价,并采用Box-Behnken试验设计响应面分析,对壶瓶枣醋醋酸发酵阶段的发酵条件进行工艺优化,为壶瓶枣和沙棘的深加工提供最佳条件。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

壶瓶枣(裂枣);沙棘:太原市小店区美特好超市;安琪葡萄酒·果酒专用酵母RW:安琪酵母股份有限公司;保加利亚乳杆菌:西安绿腾生物科技有限公司;果胶酶:巧家女旗舰店;醋酸菌:山西工商学院食品质量与安全实验室;盐酸(HCl)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、氢氧化钠(NaOH)、乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]、冰乙酸(C2H4O2)、酚酞、无水乙醇:分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司;亚甲蓝(C16H18ClN3S·3H2O)、无水葡萄糖:分析纯,天津市北辰方正化学试剂厂;酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O):分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司;亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]:分析纯,天津市申泰化学试剂有限公司;酵母浸粉:分析纯,南京茂捷微生物科技有限公司;丙三醇:分析纯,天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BCD-521WDPW 冰箱 青岛海尔集团;JA2003电子天平 上海菁海仪器有限公司;HH-T600电热恒温水浴锅 常州市双舜仪器设备有限公司;JP12D-800多功能榨汁机 苏泊尔集团有限公司;HH-S2数显二孔恒温水浴锅、TS-2102C恒温振荡培养箱、TGL-16GB高速台式离心机 常州市金坛大地自动化仪器厂;万用电炉、酒精计 北京科伟永兴仪器有限公司;PHS-3C实验室pH计 上海佑科仪器仪表有限公司;WZ-108折光仪 北京万成北增精密仪器有限公司;YXQ-75SII立式压力蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2FD超净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;101-1A恒温鼓风干燥箱 天津利康实验室设备有限公司;移液枪 上海求精仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 复合果醋的酿造工艺流程

壶瓶枣、沙棘→筛选→清洗→预煮→打浆→酶解(果胶酶)→壶瓶枣沙棘混合液→接种(酵母菌RW、保加利亚乳杆菌)→酒精发酵→发酵结束→接种醋酸菌→ 醋酸发酵→过滤→调配→杀菌→壶瓶枣沙棘复合醋。

1.3.2 操作要点

原料挑选:新鲜的壶瓶枣(半红期至全红期裂枣)、沙棘。

破碎、榨汁:破碎、去核,将果肉放入多功能榨汁机中,按质量比加入水打浆,再将枣浆与沙棘汁按4∶1 的比例混匀,得到混合液[9]。

酶解:将混合液升温至55 ℃,并加入0.2%的果胶酶,恒温酶解3.5 h,于90 ℃ 水浴锅中灭酶5～10 min。

酒精发酵:在酶解完成的混合液中,接入0.2%安琪酵母和0.08%保加利亚乳杆菌,置于25 ℃的恒温培养箱中进行48 h混合菌种的酒精发酵[10]。

醋酸菌培养、保藏与扩培:醋酸菌液体培养基:葡萄糖、酵母浸粉、蒸馏水按1∶1∶100的质量比配制液体培养基(pH 5.5),在高压灭菌锅中灭菌20 min,冷却后加入4%的无水乙醇[11]。醋酸菌的培养:超净工作台紫外杀菌30 min,向盛有50 mL液体的培养基中加入1.8 mL的无水乙醇,混匀,再将醋酸菌菌液吸取500 μL至液体培养基的三角瓶中混匀,用3层纱布封口(达到有氧条件),并在30 ℃、转速200 r/min 的恒温培养箱中培养24 h[12-13]。醋酸菌种的保藏:将培养完的菌液分装入丙三醇和水按1∶1配制的甘油管中,并将其用封口膜封口,再将其冷冻保藏。醋酸菌的扩培:用第一次培养的醋酸菌菌液进行第二次菌种扩培,向200 mL液体培养基中加入8 mL的无水乙醇,再加入10 mL二次扩培的菌液,用3层纱布封口后,在200 r/min、30 ℃的条件下恒温振荡培养24 h,最终醋酸菌菌液酸度达到3.2 g/L。

过滤、杀菌:在醋酸发酵结束后,在发酵液中加入发酵液1.5%的食盐,终止醋酸菌的活性[14],过滤后在85 ℃的条件下巴氏杀菌15 min。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 发酵温度

按照1.3.2中酒精发酵的方法发酵,酒精度为6.1%,向其中接入6%的醋酸菌,分别放在28,30,32,34,36 ℃的培养箱中恒温振荡发酵,每隔12 h取一次样,并测其总酸,直到总酸稳定,发酵结束,根据总酸确定最佳发酵温度[15]。

1.3.3.2 醋酸菌接种量

按照1.3.2中酒精发酵的方法发酵,酒精度为6.1%,向其中分别接入2%、4%、6%、8%、10%的醋酸菌,均放置在32 ℃的培养箱中恒温振荡发酵,每隔12 h取一次样,并测其总酸,直到总酸稳定,发酵结束,根据总酸确定最佳接种量。

1.3.3.3 发酵时间

按照1.3.2中酒精发酵的方法发酵,酒精度为6.1%,向其中接入8%的醋酸菌,放置在32 ℃的培养箱中恒温振荡发酵,每隔12 h取一次样,并测其总酸,直到总酸稳定,发酵结束,根据总酸确定最佳发酵时间。

1.3.4 响应面优化试验设计

根据单因素试验对发酵沙棘壶瓶枣复合枣醋进行结果分析,利用Box-Behnken试验设计,确定响应面试验的因素水平并建立回归模型。响应面试验见表1[16-18]。

表1 响应面试验设计因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test design

1.3.5 模糊数学评价

以色泽、组织形态、香气、滋味为4个评价因素集,其所占权重分别为0.2,0.3,0.2,0.3,得到因素权重集X={0.2,0.3,0.2,0.3}。将评语等级分为优(90分)、良(75分)、差(60分),得到评语等级集T={90,75,60}。确定10位评价员按照事先制定好的评定方法和标准对不同单因素的复合枣醋进行感官评定[19]。感官评定标准见表2。

表2 壶瓶枣沙棘复合枣醋的感官评定标准表Table 2 The sensory evaluation standard table of Huping jujube and sea buckthorn compound jujube vinegar

通过统计的结果,利用模糊数学原理进行评价结果分析。首先将4个评价因素的3个等级得到的人数除以评价员总人数10,得到模糊数学关系矩阵R,由此可以确定模糊关系评价集Y=X×R,最后确定复合枣醋的模糊数学综合评价总分Z=Y×T。

1.3.6 总糖、还原糖的测定

参考GB 5009.7-2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》。

1.3.7 酒精度的测定

参考GB 5009.225-2016《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》。

用蒸馏法蒸馏,取100 mL发酵液于500 mL圆底烧瓶中,加入50 mL蒸馏水,放4颗沸石在水浴锅中蒸馏,将蒸馏出的溶液定容到100 mL量筒中,将酒精计放入量筒中,同时用温度计测量温度,静置5 min,读取刻度线数值,记录温度,将读取的数据按附录进行温度校正,得到20 ℃时发酵液的酒精度[20-21]。

1.3.8 总酸的测定

参考GB 12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 发酵温度对总酸的影响

根据1.3.3.1单因素试验中的方法,不同温度下随着发酵时间的变化测定的总酸变化情况见图1。

图1 发酵温度对总酸的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on total acid

由图1可知,在不同发酵温度条件下,总酸均在72 h时达到最高值,表明发酵结束。32 ℃时,其总酸最高,为14.19 g/L。当温度高于32 ℃时,整个发酵过程中总酸都较低，原因可能是醋酸菌处在高温的环境中,使醋酸氧化生成了二氧化碳和水,从而降低了酸度。在28 ℃时总酸较低，原因可能是醋酸菌所处环境温度过低,从而抑制了醋酸菌的生长活性。从整体变化上看,温度过低或过高都不利于醋酸菌的生长繁殖,使其产酸能力下降。

2.1.2 醋酸菌接种量对总酸的影响

根据1.3.3.2单因素试验的方法,不同醋酸菌接种量在32 ℃时测定的总酸变化情况见图2。

图2 醋酸菌接种量对总酸的影响Fig.2 Effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on total acid

由图2可知,不同接种量的总酸都随着发酵时间的延长而呈逐渐上升的趋势,均在72 h时达到最大值,表明发酵结束。当接种量为8%时,其总酸最高,为15.18 g/L。当接种量小于8%时,总酸都较低，原因可能是醋酸菌菌种的添加量较少,使其产酸较少,导致总酸降低。当接种量为10%时,可能由于醋酸菌的添加量过多,使其大量生长繁殖，反而造成发酵液中的营养物质不断损耗,最终导致总酸降低。

2.1.3 发酵时间对总酸的影响

根据1.3.3.3单因素试验的方法,在32 ℃、接种量8%时,总酸随时间延长的变化情况见图3。

图3 发酵时间对总酸的影响Fig.3 Effect of fermentation time on total acid

由图3可知,随着时间的延长,总酸不断升高。最终在72 h时总酸达到最大值15.18 g/L。

2.2 模糊数学评价结果

通过模糊数学综合评价方法,参照表2的感官评价标准对不同参数条件下的复合枣醋进行感官评价,评价结果见表3。

表3 复合枣醋的感官评分结果Table 3 The sensory scoring results of compound jujube vinegar

从10位评价人员的评价结果的差异性中，可以建立出模糊矩阵。例如，1号样品的评价结果，色泽方面：优5人，良2人，差3人；组织状态方面：优7人，良2人，差1人；香气方面：优4人，良5人，差1人；滋味方面：优5人，良2人，差3人。

同理，可得到评价结果集，见表4。

表4 复合枣醋的评价结果集Table 4 The evaluation result set of compound jujube vinegar

续 表

由表4可知,样品12号、10号、16号的感官评分较高,分别为87.3,86.6,86.6分。

2.3 响应面优化试验

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,进行三因素三水平试验,设计了17组试验,试验设计及结果见表5[22-23]。

表5 响应面试验的设计及结果Table 5 The design and results of response surface test

表6 总酸的回归模型方差分析及显著性检验Table 6 Regression model variance analysis and significance test of total acid

续 表

根据表5中总酸的试验数据对其进行二次多项回归拟合，可以得到回归方程：Y=15.17-0.39A+0.32B+0.73C+0.33AB+0.018AC-1.10BC-1.46A2-0.35B2-1.95C2。

由表6可知,在总酸方面,该模型的P值<0.01,说明模型具有极显著性。发酵时间(A)和醋酸菌接种量(B)两因素的交互作用具有显著性,醋酸菌接种量(B)与发酵时间(C)二者的交互作用具有极显著性。RAdj2和RPred2之间的差值<0.2,说明模型和变异系数较高,模型的准确性较高。失拟项的P>0.05,不显著,表明拟合程度好。R2=0.987 8,说明建立的模型可以解释98.78%的响应值。F值表明对总酸的影响,F值越大,其对总酸的影响越大,所以,各因素对复合枣醋总酸的影响作用大小为发酵时间>发酵温度>醋酸菌接种量。

a

由图4中的等高线图和3D 响应曲面图可以得出3个单因素对总酸的影响,因素之间交互作用的强弱可以通过分析等高线图中的线条和形状来判断,线条越密集越多、形状越趋于椭圆形,其影响作用越大;在3D图中的坡度越陡,其交互作用影响越大;反之对因素的影响越小。由图4中a和b可知,因素A发酵温度比因素B醋酸菌接种量的线条更密集,发酵温度的响应曲面图的坡度更陡,证明发酵温度较醋酸菌接种量对交互作用的影响更大。同理,分析图4中c, d, e, f 可知,发酵时间较发酵温度、醋酸菌接种量的影响作用更强。综上可知,3个因素对复合枣醋总酸的影响大小顺序为发酵时间>发酵温度>醋酸菌接种量,该响应面图的分析结果与回归模型的方差分析结果一致。

以总酸为指标的响应面优化试验预测得出最佳工艺为发酵温度31.79 ℃、醋酸菌接种量8.44%、发酵时间73.49 h,总酸为15.26 g/L。对其进行验证试验和模糊数学感官评价,总酸为15.29 g/L,与响应面预测值相近,感官评分为87.41分。

表7 感官评分的回归模型方差分析及显著性检验Table 7 Regression model variance analysis and significance test of sensory score

根据表7中对感官评分的回归模型方差分析，可以得到二次回归方程：Y=86.34-0.96A+0.86B+1.67C+1.84AB-0.38AC-2.21BC-3.38A2-2.22B2-3.38C2。

由表7可知,该模型的P值为0.000 1,表明该试验的感官评价得到的二次多项模型差异具有极显著性。依据显著性分析可得,交互项AB、BC的P值均小于0.01,说明二者的交互作用对感官评分的影响都极显著。失拟项的P>0.05,不显著,说明模型与试验数据拟合度良好。通过对比分析各因素对响应值的影响,可知复合枣醋感官评分的影响作用大小为发酵时间>发酵温度>醋酸菌接种量[24]。

a

由图5可知,3个因素间交互作用对感官评分的影响大小同对总酸的作用影响分析方法相同,感官评分方面:发酵温度的影响比醋酸菌接种量更大,发酵时间的影响比醋酸菌接种量更大。综上可知,发酵时间>发酵温度>醋酸菌接种量,该结果与方差分析所得结果一致[25]。

以感官评分为指标进行响应面优化试验预测得出最佳工艺条件为发酵温度31.69 ℃、醋酸菌接种量8.01%、发酵时间75.05 h,该条件下感官评分为86.627 4分。该预测值与模糊数学评价结果相近,说明该模型的拟合程度较好。

2.4 响应面结果验证试验

为了验证响应面预测结果的准确性,以感官评分为评价指标,在最佳条件下做3次平行试验,工艺参数为发酵温度31.69 ℃、醋酸菌接种量8.01%、发酵时间75.05 h,此条件下的总酸为15.31 g/L,感官评分为86.7分,与响应面的理论预测值相近。在总酸的响应面验证试验中,其最优工艺评分为85.5分,说明不能直接由总酸判断枣醋的风味品质。

3 结论

通过以壶瓶枣沙棘复合枣醋的总酸和感官评分为指标进行响应面优化,在进行验证试验后,确定制备该复合枣醋的最佳条件为发酵温度31.69 ℃、醋酸菌接种量8.01%、发酵时间75.05 h,此条件下总酸为15.31 g/L,感官评分为86.7分。发酵的复合枣醋的枣醋味浓郁同时伴有沙棘醋味,呈澄清明亮的浅琥珀色,香味柔和。