南极磷虾自溶物深度酶解产物鲜味研究

王梦娟，王灵昭*，顾涵，陈康瑞，程远霞，邱春江，盘赛昆，颜冬梅

(1.江苏海洋大学 江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏 连云港 222005；2.江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005；3.连云港百鲜屋食品有限公司，江苏 连云港 222199)

南极磷虾(Euphausiasuperba)因其巨大的生物量和潜在的渔业资源而日益受到人们的关注[1]，其总生物量和每年后期幼体总产量分别是1.17～3.79亿吨和3.42～5.36亿吨[2]，年可捕量在0.6～1亿吨[3]。南极磷虾的一个显著特征是体内含有功能强大且能够降解各种蛋白质的酶系统[4]。南极磷虾死后，由于体内酶抑制系统活性降低而极易自溶[5]。

利用南极磷虾自溶物制备调味品基料，可以减少外源酶的使用，节省成本，且反应易被热处理终止[6]。

鲜味在东方国家深受喜爱，已被广泛接受为区别于酸、甜、苦、咸4种基本滋味的第5种基本滋味[7]。近年来，营养型鲜味调味料备受青睐，增速迅猛，该类调味料内含动植物蛋白水解产物，可增强食物风味，同时补充人体的必需氨基酸、小分子肽等营养成分[8]。

在南极磷虾自溶处理后，再加入外源蛋白酶进一步使南极磷虾深度酶解，一方面可以提高原料蛋白质利用率，另一方面可以获得更多氨基酸或小分子肽。因此，本文以产物的鲜味品质为导向，研究南极磷虾自溶后产物的深度酶解工艺以及产物品质，旨在为高效利用南极磷虾生产优质营养型鲜味调味料提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冰鲜南极磷虾虾砖：购于上海亿鑫水产品有限公司，置于-50 ℃条件下备用；柠檬酸、三聚磷酸钠(食品级)：购于上海联合食品添加剂有限公司；碱性蛋白酶(2×104U/g)、中性蛋白酶(2×104U/g)、胰蛋白酶(3×104U/g)、木瓜蛋白酶(3×104U/g)：购于伊势久生物科技有限责任公司；其他生化试剂(均为分析纯)：购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TL-5.0台式离心机 上海市离心机械研究所有限公司；767多功能养生破壁机 中山市贝壳电器有限公司；GL-3250B磁力搅拌器 其林贝尔仪器制造有限公司；S20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9240A鼓风干燥箱、真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；L-8900高速氨基酸分析仪 日本株式会社日立高新技术科学那柯事业所。

1.3 实验方法

1.3.1 南极磷虾自溶物深度酶解流程

将冰鲜南极磷虾虾砖粉碎、自溶，然后添加外源蛋白酶酶解，灭酶、离心，取液相进行感官评价。

参考Wang等的方法自溶，并作如下修改：向粉碎后的磷虾中加水(虾∶水为2∶7，质量比)匀浆，调节pH至7.5，在43.2 ℃下搅拌自溶5 h。酶解时，加入不同的外源蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶)，用1%的柠檬酸或三聚磷酸钠调节pH，控制酶解温度和时间进行酶解，然后灭酶(100 ℃，10 min)、离心(6 000 r/min，10 min)，得到液相样品。

1.3.2 酶的种类对酶解液鲜味强度的影响

任务与其所属区域中心点的距离Ri:完成与未完成的平均灰色关联度为0.90385，是四大影响因素中相对较低的，但是也不可忽视。四大影响因子的平均关联度都在0.9以上，影响因素定义正确且不可忽视。

在自溶物中加入3 000 U/g不同的蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶)，并调节至不同的pH(中性蛋白酶pH 6.0，木瓜蛋白酶pH 7.0，碱性蛋白酶pH 10.0，胰蛋白酶pH 8.0)，在43.2 ℃下酶解4 h，然后灭酶、离心，得到液相样品，对样品进行鲜味强度的感官评价，并计算酶解液得率。酶解液得率定义为样品体积占自溶时加水体积的百分比。

1.3.3 酶添加量对酶解液鲜味强度的影响

在自溶物中按不同的量(2 500，3 000，3 500，4 000，4 500 U/g)加入最佳的蛋白酶，调节pH，在43.2 ℃下酶解4 h，然后灭酶、离心，得到液相样品，对样品进行鲜味强度的感官评价。

1.3.4 酶解时间对酶解液鲜味强度的影响

在自溶物中按最佳的量加入最佳的蛋白酶，调节pH，在43.2 ℃下酶解不同时间(3，3.5，4，4.5，5 h)，然后灭酶、离心，得到液相样品，对样品进行鲜味强度的感官评价。

1.3.5 酶解温度对酶解液鲜味强度的影响

在自溶物中按最佳的量加入最佳的蛋白酶，调节pH，在不同温度下(50，55，60，65，70 ℃)酶解最佳时间，然后灭酶、离心，得到液相样品，对样品进行鲜味强度的感官评价。

1.3.6 酶解工艺优化

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.7 感官评价

以0.35%的味精溶液为标准品，用评分法对样品进行感官评价[9]。

感官评价室温度控制在(25±2) ℃, 评价小组由10名成员组成。样品评分从0分到10分，0分表示被检测的样品没有鲜味，而10分则表示样品具有最强的鲜味。0.35%的味精标准品溶液的鲜味强度为5分，将样品与标准品进行比较，然后予以打分评价[10]。

1.3.8 样品的理化分析

对最优工艺下的样品进行化学分析。水分含量分析采用GB 5009.3-2016第一法；蛋白质含量分析采用GB 5009.5-2016 第一法。

氨基酸含量分析参考GB 5009.124-2016中的方法：酸水解时，称取0.050 g干燥后的样品，加入10 mL 6 mol/L HCl溶液，充氮封管，在110 ℃下水解22～24 h，取出冷却，过滤至50 mL，吸取1 mL于离心管中，在65 ℃下真空干燥，干燥后加入1 mL 0.02 mol/L的HCl溶液，过0.22 μm针筒滤膜后测定。碱水解参考周虹等[11]的方法：称取0.100 g样品，加入1.5 mL 4 mol/L的NaOH溶液，充氮封管，110 ℃水解22～24 h，冷却后加入1 mL 6 mol/L的HCl溶液，过滤后用0.02 mol/L盐酸定容至50 mL，摇匀，取1 mL过0.22 μm针筒滤膜后测定。

1.3.9 统计分析

采用SPSS软件分析数据，用方差分析(ANOVA)比较数据差异性。

2 结果与分析

2.1 酶的种类对酶解液鲜味强度的影响

酶的种类对酶解液鲜味强度的影响见图1。

图1 酶的种类对酶解液鲜味强度的影响Fig.1 Effect of types of enzymes on umami intensity of enzymatic hydrolysates注：相同指标下，不同字母表示结果具有显著差异(P<0.05)，下图同。

由图1可知，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解液的鲜味强度无显著性差异(P>0.05)，而碱性蛋白酶酶解液的鲜味强度显著高于其他3种蛋白酶酶解液的鲜味强度(P<0.05)。此外，碱性蛋白酶的酶解液得率为108.7%，与其他蛋白酶的酶解液得率无显著性差异(P>0.05)。因此，最佳的蛋白酶为碱性蛋白酶，后续采用碱性蛋白酶进行酶添加量、酶解时间、酶解温度对酶解液鲜味强度的影响研究。刘璐等[12]对南极磷虾酶解工艺的研究表明，碱性蛋白酶是酶解反应的最佳蛋白酶，与本研究结果相似。

2.2 酶添加量对酶解液鲜味强度的影响

酶添加量对酶解液鲜味强度的影响见图2。

图2 酶添加量对酶解液鲜味强度的影响Fig.2 Effect of enzyme addition amount on umami intensity of enzymatic hydrolysates

由图2可知，碱性蛋白酶添加量为3 000 U/g时，酶解液的鲜味强度显著高于其他添加量下酶解液的鲜味强度(P<0.05)。这可能是因为碱性蛋白酶添加量的不同使得酶解液中鲜味氨基酸或鲜味肽的生成情况不同，产物成分的不同导致酶解液的鲜味强度不同。此外，碱性蛋白酶添加量为3 000 U/g时，酶解液得率为115.0%，与其他添加量下的酶解液得率无显著性差异(P>0.05)。因此，最佳的酶添加量为3 000 U/g，后续采用此添加量进行酶解时间、酶解温度对酶解液鲜味强度的影响研究。

2.3 酶解时间对酶解液鲜味强度的影响

酶解时间对酶解液鲜味强度的影响见图3。

图3 酶解时间对酶解液鲜味强度的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on umami intensity of enzymatic hydrolysates

由图3可知，酶解时间为4 h时，酶解液的鲜味强度显著高于其他酶解时间下酶解液的鲜味强度(P<0.05)，酶解时间少于或多于4 h均导致酶解液的鲜味强度显著下降(P<0.05)。这可能是因为随着酶解时间的延长，酶解产物中氨基酸和肽的组成发生变化，鲜味氨基酸或鲜味肽的相对含量下降，而一些苦味或其他不良风味的成分增加。此外，酶解时间为4 h时，酶解液得率为106.3%，与其他酶解时间下的酶解液得率无显著性差异(P>0.05)。因此，最佳的酶解时间为4 h，后续采用此酶解时间进行酶解温度对酶解液鲜味强度的影响研究。

2.4 酶解温度对酶解液鲜味强度的影响

酶解温度对酶解液鲜味强度的影响见图4。

图4 酶解温度对酶解液鲜味强度的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on umami intensity of enzymatic hydrolysates

由图4可知，酶解温度为60 ℃时，酶解液的鲜味强度显著高于其他酶解温度下酶解液的鲜味强度(P<0.05)，酶解温度低于或高于60 ℃均导致酶解液的鲜味强度显著下降(P<0.05)。这可能是因为随着温度的上升，蛋白酶高温变性导致酶活力降低[13]，产物中的鲜味成分在高温的作用下生成量减少。此外，不同酶解温度下酶解液得率没有显著性差异(P>0.05)。因此，最佳酶解温度为60 ℃。满洋等[14]研究发现，南极磷虾副产物酶解蛋白胨工艺的适宜温度为60 ℃，与本研究结果相似。

2.5 酶解工艺优化

酶解工艺优化的实验结果见表2。

表2 正交实验设计及酶解产物的鲜味强度Table 2 Orthogonal experimental design and umami intensity of enzymatic hydrolysates

由表2可知，4个因素对鲜味强度影响程度的主次顺序为酶添加量>酶的种类>酶解温度>酶解时间；酶解工艺的最佳条件为A3B2C2D3，即在碱性蛋白酶添加量2 800 U/g、酶解温度60 ℃、酶解时间4 h的条件下，酶解产物鲜味强度最大。对该条件进行验证实验，结果表明，酶解液的鲜味强度为8.4，酶解液得率为116.2%。进一步分析此条件下的酶解液水分含量和蛋白质含量，结果表明，水分含量为96.4 g/100 g，蛋白质含量为2.95 g/100 g。

2.6 最优酶解工艺下产物的氨基酸分析

表3 南极磷虾深度酶解产物的氨基酸组成Table 3 Amino acid composition of deep enzymatic hydrolysates from Antarctic krill

续 表

由表3可知，依据FAO/WHO对成人/婴幼儿的氨基酸模式要求，酶解液中含有9种人体必需氨基酸。总氨基酸含量为3.03 g/100 g，必需氨基酸占比为53.79%，非必需氨基酸占比为49.17%。酶解液中的组氨酸不能满足FAO/WHO对成人/婴幼儿的要求，因而为限制性氨基酸。根据氨基酸滋味不同，可以将其分为甜味氨基酸、苦味氨基酸、鲜味氨基酸和无味氨基酸，鲜味氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，甜味氨基酸包括苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸，苦味氨基酸包括组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸，其余氨基酸为无味氨基酸[16-18]。因此，酶解液含有鲜味氨基酸0.82 g/100 g，占比为27.06%；含有甜味氨基酸0.58 g/100 g，占比为19.15%。酶解液的鲜味氨基酸含量较高，甜味氨基酸主要为丙氨酸。丙氨酸除了可以提供甜味外，还可以与鲜味氨基酸起到协同提鲜的作用[19]。

3 结论

以利用南极磷虾制备鲜味调味料为目标，研究了南极磷虾自溶物深度酶解工艺及产物品质。结果表明，以产物的鲜味强度为指标，深度酶解的最佳条件为选用碱性蛋白酶，酶添加量2 800 U/g，酶解温度60 ℃，酶解时间4 h。此条件下，酶解产物得率为116.2%，酶解液含有蛋白质2.95 g/100 g、水分96.4 g/100 g。酶解液的氨基酸组成分析表明，总氨基酸含量为3.03 g/100 g，鲜味氨基酸占比27.06%，甜味氨基酸占比19.15%。研究结果为以南极磷虾为原料，利用“自溶复合深度酶解”技术制备优质营养型鲜味调味料提供了理论和技术支持。