粉尘螨多态性微卫星标记的开发与评价

王慧慧，方惟希，王 铎，刘 艺，李咏琪，李幸蓉，陈子健，叶长江，孙恩涛

(皖南医学院 1.临床医学院;2.检验学院，安徽 芜湖 241002)

粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)属无气门股、麦食螨科，生境广泛，常孳生于房舍灰尘、空调隔尘网、面粉、饲料和中药材等房舍和储藏物。粉尘螨是引起过敏性疾病最主要的吸入性过敏原之一[1-2]。有效控制环境中的尘螨数量，对预防和治疗过敏性疾病有积极作用[1-4]。研究粉尘螨种群遗传变异，可为有效制定粉尘螨防控策略提供数据支持。

微卫星标记是以重复单位(1～6 bp)的核苷酸序列首尾相连为核心序列，由于基本核心序列的重复次数不同，因而存在多态性。微卫星标记两端的序列保守，可用于设计特异性引物。微卫星标记具有数量丰富，在基因组中分布广，多态性丰富，呈孟德尔共显性，检测快速方便等优点，常用于评估物种的遗传多样性和遗传分化、构建基因组连锁图谱等。目前，微卫星标记技术广泛应用于螨类研究，但关于螨类微卫星的报道多集中于农业螨类，尘螨微卫星相关报道较少。本研究应用二代测序技术开发粉尘螨多态性微卫星位点并设计引物，以期为粉尘螨种群遗传变异研究提供更多的分子标记。

1 材料与方法

1.1 样本采集与鉴定 样本采自安徽省芜湖市某校宿舍内，经形态学鉴定为粉尘螨后，进行实验室纯培养。同时，收集不同生境种群的单个粉尘螨，75%乙醇固定，-20℃保存备用。

1.2 提取DNA 挑选1 000只粉尘螨，使用酚氯仿法提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，紫外分光光度计(NanoDrop 2000)检测DNA的纯度和浓度。粉尘螨基因组DNA检测合格后，送上海美吉生物公司进行高通量测序。同时，经STE法提取单只粉尘螨DNA。

1.3 高通量测序 采用Illumina HiSeqTM平台对本研究提取的粉尘螨基因组DNA进行测序，以NCBI现有的粉尘螨全基因组序列https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/9138为参考基因，用BWA软件将测序所得数据比对到参考基因上，最后经GATK的BestPractices流程校正[5]，获得完整粉尘螨全基因组序列。

1.4 微卫星位点筛选与引物设计 采用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)筛选出重复次数12次以上的单核苷酸、重复6次以上的二核苷酸、重复5次以上的三或四核苷酸微卫星标记，建立粉尘螨基因组的微卫星文库。根据多样本基因组高通量测序数据，从微卫星文库中筛选出等位基因大于3的微卫星位点。最后，针对筛选出的粉尘螨微卫星位点，通过Primer5设计微卫星引物。

1.5 粉尘螨微卫星标记引物的筛选 将上述引物溶解稀释至0.1 μm，进行PCR扩增验证。PCR循环设置条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，使用温度梯度(51℃、54℃、57℃、60℃)测试最佳退火温度，72℃延伸1 min 30 s，循环34次，72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶筛选出PCR产物长度符合预期，条带单一的引物同时依据条带质量确定退火温度。对通过筛选的引物进行荧光引物设计，每对引物上游5′端用荧光染料进行标记，随后对从房舍和储藏环境中获取的3个种群共15只粉尘螨样本DNA进行扩增，PCR产物经由1%琼脂糖凝胶电泳检测后,送至安徽通用生物系统有限公司进行毛细管电泳分型。

1.6 种群遗传学分析 以15只粉尘螨个体的基因组DNA为模板，对1筛选的微卫星标记的种群遗传学特征进行评价。通过GeneMarker 2.2软件读取分析每个个体每个位点的等位基因长度,使用Excel对荧光标记毛细管电泳结果进行汇总。使用GenAlEx 6.502计算粉尘螨的等位基因数Na、有效等位基因数Ne、观测杂合度Ho、期望杂合度He、香农指数I。利用Cervus 3.0程序分析多态性信息含量PIC。

2 结果

2.1 粉尘螨微卫星序列组成及相关特征 Illumina测序平台共返还6 635 622条高质量的Reads。通过MISA软件的筛选，共筛选出266个候选微卫星标记。其中，三核苷酸最多，共计118条，占总数量的44.36%，其次是单核苷酸，共计98条，占总数量的36.84%，二核苷酸重复共计43条，占16.17%，四核苷酸重复共计7条，占2.64%。

微卫星标记重复单元类型显示，单核苷酸仅有A/T重复单元，共98个。二核苷酸一共有TC/GA、AT/AT、AC/GT 3种类型，其中AC/GT占二核苷酸重复总数的74.42%，是出现频率最高的二核苷酸序列，其次是AT/AT(13.95%)。三核苷酸的种类最多，ATG/CAT重复的数量最多，占三核苷酸重复总数的50%，GTT/AAC的重复数量次之(33.86%)，AAT/ATT占11.86%，CTG/CAG占3.39%，TCG/CGA与TGG/CAA均只有1个，各占0.85%。在四核苷酸重复中，TTCA/TGAA数量最多，但仅有3个，占四核苷酸总重复数量的28.57%。其次，ATTG/CAAT为2个，占28.57%，TTTG/CAAA和TTTC/GAAA均只有1个，各占14.29%。在粉尘螨微卫星位点中，A/T重复出现次数最多，其次是ATG/CAT。

2.2 微卫星引物的筛选 共有22对引物在退火温度为60℃时，扩增出单一目的片段。用上述22对微卫星引物对15个单只粉尘螨DNA进行PCR扩增，其产物通过毛细管电泳检测。用GeneMarker 2.2对原始数据进行分析处理，由于检测数据和结果较多，在此选取Df 01位点的2个样本的系列图峰作为示例描述(图1)。2个粉尘螨样本在Df 01处有3个等位基因，其中，一个样本为杂合子，另一个为纯合子。使用Excel对荧光标记毛细管电泳结果进行汇总，用GenAlEx 6.502、Cervus 3.0分析发现，22对微卫星引物中有12个显示出较高的多态性，可进一步用于粉尘螨遗传多样性分析(表1)。

图1 粉尘螨不同个体在微卫星位点Df 01的毛细管电泳

表1 粉尘螨12个微卫星引物序列及位点信息

2.3 微卫星标记的种群遗传学评价 用筛选出的12对引物对3个种群15只粉尘螨样本进行扩增，共检测到66个等位基因，微卫星位点的遗传多样性参数分析显示，12个位点的等位基因数Na为3～9，平均为5.5±1.893。各位点有效等位基因数Ne为1.411～4.840，平均为3.150±1.204。观测杂合度Ho为0.133～0.800，平均为0.495±0.213，期望杂合度He为0.291～0.793，平均为0.618±0.176。各位点的香农指数I为0.563～1.807，平均为1.267±0.428。Df 08香农信息指数最大，为1.807；Df 10香农信息指数最小，为0.563。本研究中所筛选的微卫星位点多态信息含量为0.271～0.765，平均为0.581±0.176，多态信息含量最高的是Df 08，最低的是Df 10(表2)。

表2 12个微卫星标记的种群遗传学参数

3 讨论

微卫星标记是目前被广泛认可和使用的遗传标记之一，应用于分子遗传学与进化生物学等方面[6-7]。微卫星标记的获取主要基于二代测序技术的全基因组筛选法、基因组富集文库法、近缘杂交扩增法、AFLP、ISSR、RAPD等方法[8-10]。传统的开发引物方法大多费时费力，基于二代测序及毛细管电泳技术的微卫星引物开发方法具有效率高、速度快、成本低等特点[11]。贾浩源等[12]基于二代测序技术获取腐食酪螨转录组数据，提高了微卫星标记的开发效率。本研究基于NCBI上的粉尘螨全基因组序列，用Illumina HiSeqTM平台高通量测序技术进行重新测序，比对原有序列后用MISA软件查找和筛选出位点。其次，根据多个样本基因组高通量测序数据，筛选多态性高的位点，显著提升了微卫星标记的开发效率。最后，利用高效毛细管电泳技术对位点多态性进行验证。

本研究中的粉尘螨完整型微卫星中，三碱基微卫星分布数目最多，这与已报道的柑橘全爪螨和Phytoseiulusmacropilis的优势碱基类型不同，且Phytoseiulusmacropilis微卫星标记中二核苷酸重复的占比最多，其次为四、三、五核苷酸重复[13-14]。由于不同物种的优势微卫星类型各不相同，因此，不同物种的微卫星既存在基因组间的进化现象，也可能存在一定的保守现象[15]。

本研究筛选出266个SSR位点，再对微卫星位点进行引物设计，经PCR验证与荧光标记毛细管电泳，最终获取了12对具有多态性、扩增稳定、条带清晰单一的粉尘螨微卫星引物。12对多态性引物大小为20～25 bp，退火温度为60℃时，均可扩增出目的片段，片段长度约为166～276 bp，符合微卫星引物的设计原则[16]。

本研究中微卫星标记多态信息含量为0.271～0.765，这与Sun等[17]开发的15对柑橘全爪螨多态性微卫星引物的多态性信息含量相近。根据Botsetin等[18]对多态信息含量的量度规定，12个具多态性的微卫星位点中有8个属于高度多态性位点，4个属于中度多态性位点。因此，本研究的12对粉尘螨微卫星引物位点均具有良好的多态性，可为粉尘螨的遗传多样性与遗传结构分析提供高效的微卫星标记。