温针灸联合中药对类风湿关节炎患者血清 miR-335-5p和miR-141表达的影响

林广清,邓玲琳,彭叶

(1.广东省第二中医院,广州 510095;2.广州中医药大学,广州 510405)

类风湿关节炎为自身免疫结蹄组织病,在生活中较为常见,晨僵、小关节肿胀与疼痛是主要表现,治疗不及时易导致关节畸形与残废,使患者的正常生活受到影响[1]。类风湿关节炎发生时易伴随慢性疼痛与关节骨质受损,且易反复发作,给患者带来较大压力[2]。随着类风湿关节炎的发病数升高,寻找有效的治疗方法十分重要。温针灸为针刺与艾灸的结合,能行气活血、温通经脉,可用于治疗关节痹痛与肌肤不仁[3]。桂枝芍药知母汤可治疗痹病,有解毒止痛、活血通络与利湿散寒的功效[4]。目前临床上关于温针灸联合桂枝芍药知母汤治疗类风湿关节炎的报道较少,故本研究对此展开临床观察。

1 临床资料

1.1 一般资料

选取2019年3月至2020年3月广东省第二中医院收治的 156例类风湿关节炎患者作为研究对象,采用随机数字表法分为对照组和研究组,每组78例。对照组中男46例,女32例;年龄43～80岁,平均(58±19)岁;病程1～13年,平均(12.62±2.64)年。研究组中男40例,女38例;年龄44～81岁,平均(59±19)岁;病程1～14年,平均(13.02±3.05)年。两组患者一般资料比较,差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。本研究经广东省第二中医院伦理委员会批准[批准号(2019)伦审第(40)号]。

1.2 纳入标准

①符合《类风湿关节炎中西医结合医疗质量控制指标专家共识(2021年版)》[5]中类风湿关节炎的诊断标准;②休息时存在关节疼痛;③关节晨僵超过 1 h;④关节压痛数超过8个;⑤患者年龄＞40岁;⑥病程不限;⑦患者家属均同意参加并签署知情同意书。

1.3 排除标准

①关节严重畸形者;②关节功能丧失者;③有关节外伤史者;④合并有心血管疾病者;⑤有精神障碍者。

2 治疗方法

两组患者均采用常规治疗。口服甲氨蝶呤(湖州展望药业有限公司,国药准字 H20003089,规格2.5 mg/片)10 mg,每周1次,共服用8周。

2.1 对照组

予口服桂枝芍药知母汤治疗。组方为甘草 10 g,白芍药10～30 g,生姜15 g,白术15 g,知母10～15 g,当归15 g,防风15 g,麻黄10 g,附子15～60 g。每日1剂,水煎服2次,分早、中、晚3次服用,共服用8周。

2.2 研究组

在口服桂枝芍药知母汤基础上联合温针灸治疗。足三里为主穴,上肢配穴为外关、阳池、八邪、曲池和阳溪,下肢配穴为丘墟、解溪、八风、内膝眼和昆仑。穴位皮肤常规消毒,用0.30 mm×40 mm毫针刺入穴位。取10个穴位(主穴、上肢4个穴位和下肢4个穴位),将长2 cm艾段插入针柄并点燃,保持艾段与皮肤相距约3 cm,每个穴位灸2壮。每日治疗1次,治疗8周。

3 治疗效果

3.1 观察指标

3.1.1 关节压痛、肿胀和僵硬以及握力

观察并记录两组患者治疗前后关节压痛个数、肿胀个数和关节僵硬时间。治疗前后分别采用握力器检测患者握力水平。

3.1.2 中医证候积分

根据《中药新药临床研究指导原则(试行)》[6]中相关标准分为主症和次症。主症包括关节压痛、关节肿胀、屈伸不利和晨僵,次症包括阴雨天加重、皮肤发红和畏恶风寒。按照严重程度,主症依次计 0～6分,次症依次计0～3分;分值与症状严重程度成正比。

3.1.3 免疫球蛋白 A(immunoglobulin A, IgA)、免疫球蛋白 G(immunoglobulin G, IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)水平

治疗前后分别采集所有患者清晨空腹静脉血4 mL,离心处理 10 min,分离上层血清,-80 ℃保存待检。采用免疫散热比浊法检测血清IgA、IgG和IgM水平。

3.1.4 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-37(interleukin 37, IL-37)和白介素-6(interleukin 6, IL-6)水平

治疗前后分别采集所有患者清晨空腹静脉血4 mL,离心处理 10 min,分离上层血清,-80 ℃保存待检。采用酶联免疫吸附法检测血清TNF-α、IL-37和IL-6水平。

3.1.5 微小 RNA-335-5p(miR-335-5p)和微小 RNA-141(miR-141)表达

治疗前后分别采集所有患者清晨空腹静脉血4 mL,离心处理 10 min,分离上层血清,-80 ℃保存待检。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测 miR-335-5p和miR-141水平。参照Trizol试剂盒提取总RNA,使用逆转录获得总cDNA,采用Primer5.0软件设计特异引物,扩增体系为2 μL cDNA和0.4 μL正向引物以及0.4 μL反向引物,扩增条件为25 ℃ 10 min、48 ℃30 min、95 ℃ 5 min共进行 40个循环,采用 2-△△Ct方法计算出外周血表达量。miR-335-5p上游引物序列为 5’-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGC-3’,下游引物序列为5’-CUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3’;miR-141上游引物序列为 5’-GCCTGTAGCTTTTCCTACT-3’,下游引物序列为5’-CACGGCGGTTCGTCGAGT-3’;内参U6引物序列为上游 5’-TCCAAACTAACCTTGTGCCATAC-3’、下游5’-ACACCCTTGGGTACTACATCTCC-3’。

3.1.6 不良反应发生情况

治疗过程中,观察并记录两组不良反应发生情况。

3.2 疗效标准[6]

显效:关节疼痛和麻木消失,相关指标恢复正常。

有效:关节疼痛减轻,相关指标好转。

无效:关节疼痛和麻木未减轻。

总有效率＝[(显效+有效)例数/总例数]×100%。

3.3 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件进行分析处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用独立样本t检验,组内比较采用配对t检验。计数资料比较采用卡方检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3.4 治疗结果

3.4.1 两组治疗前后关节压痛、肿胀和僵硬以及握力比较

由表1可见,两组治疗前关节压痛、肿胀和僵硬以及握力比较,差异无统计学意义(P＞0.05);两组治疗后关节压痛个数和肿胀个数均减少(P＜0.05),僵硬时间缩短(P＜0.05),握力水平提高(P＜0.05);研究组治疗后上述指标均优于对照组(P＜0.05)。

表1 两组治疗前后关节压痛、肿胀和僵硬以及握力比较 (±s)

表1 两组治疗前后关节压痛、肿胀和僵硬以及握力比较 (±s)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05;1 mmHg≈0.133 kPa。

组别 例数 关节压痛个数(个) 关节肿胀个数(个)治疗前 治疗后10.22±1.03 5.02±0.511)10.20±1.02 3.41±0.341)2)晨僵时间(min) 治疗前 治疗后对照组 78 4.99±0.04 3.51±0.361)研究组 78 5.00±0.05 2.12±0.211)2)组别 例数 握力(mmHg)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 78 125.32±12.55 67.52±6.751) 11.61±1.16 15.62±1.561)研究组 78 125.01±12.50 51.18±5.221)2) 11.60±1.15 19.65±1.961)2)

3.4.2 两组治疗前后中医证候积分比较

由表2可见,两组治疗前患者各项中医证候积分比较,差异无统计学意义(P＞0.05);两组治疗后各项中医证候积分均降低(P＜0.05),且研究组治疗后各项中医证候积分均低于对照组(P＜0.05)。

表2 两组治疗前后中医证候积分比较 (±s,分)

表2 两组治疗前后中医证候积分比较 (±s,分)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05。

组别 例数 关节压痛 关节肿胀 屈伸不利治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 78 4.25±0.43 2.59±0.261) 4.31±0.43 2.55±0.261) 3.88±0.38 1.85±0.191)研究组 78 4.23±0.42 1.41±0.141)2) 4.30±0.43 1.62±0.161)2) 3.89±0.39 1.22±0.121)2)组别 例数 晨僵 皮肤发红治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 78 3.62±0.37 1.91±0.201) 1.75±0.18 1.05±0.111)研究组 78 3.60±0.36 1.22±0.121)2) 1.74±0.17 0.68±0.071)2)组别 例数 阴雨天加重 畏恶风寒治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 78 1.45±0.15 0.77±0.071) 1.55±0.16 1.06±0.111)研究组 78 1.44±0.14 0.39±0.041)2) 1.54±0.15 0.58±0.051)2)

3.4.3 两组治疗前后血清免疫球蛋白水平比较

由表3可见,两组治疗前血清IgA、IgG和IgM水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05);两组治疗后血清 IgA、IgG和 IgM水平低于同组治疗前(P＜0.05),且研究组治疗后血清IgA、IgG和IgM水平均低于对照组(P＜0.05)。

表3 两组治疗前后血清免疫球蛋白水平比较 (±s, g/L)

表3 两组治疗前后血清免疫球蛋白水平比较 (±s, g/L)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05。

组别 例数 IgA IgG IgM治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 78 3.21±0.33 2.46±0.311) 20.36±2.18 14.62±1.521) 1.40±0.15 1.05±0.111)研究组 78 3.20±0.32 2.15±0.261)2) 20.38±2.20 10.09±1.211)2) 1.39±0.14 0.89±0.091)2)

3.4.4 两组治疗前后血清炎症因子水平比较

由表4可见,两组治疗前血清 TNF-α、IL-37和IL-6水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05);两组治疗后血清TNF-α、IL-37和IL-6水平均降低(P＜0.05),且观察组治疗后TNF-α、IL-37和IL-6水平均低于对照组(P＜0.05)。

表4 两组治疗前后血清炎症因子水平比较 (±s, ng/L)

表4 两组治疗前后血清炎症因子水平比较 (±s, ng/L)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05。

组别 例数 TNF-α IL-37 IL-6治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 78 241.36±25.61 166.30±18.631) 220.58±24.06 150.36±17.041) 34.10±3.46 26.52±2.651)研究组 78 240.94±24.09 129.55±14.261)2) 221.01±23.95 95.85±10.361)2) 33.99±3.41 15.42±1.541)2)

3.4.5 两组治疗前后血清miR-335-5p和miR-141表达比较

由表5可见,两组治疗前血清 miR-335-5p和miR-141表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05);两组治疗后血清 miR-335-5p表达升高(P＜0.05),miR-141表达降低(P＜0.05);观察组治疗后血清miR-335-5p表达高于对照组(P＜0.05),血清miR-141表达低于对照组(P＜0.05)。

表5 两组治疗前后血清miR-335-5p和miR-141表达比较 (±s)

表5 两组治疗前后血清miR-335-5p和miR-141表达比较 (±s)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05。

组别 例数 miR-335-5p miR-141治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 78 1.56±0.16 3.61±0.361) 2.61±0.26 1.85±0.191)研究组 78 1.55±0.15 5.24±0.521)2) 2.60±0.25 1.05±0.111)2)

3.4.6 两组临床疗效比较

由表6可见,观察组总有效率高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表6 两组临床疗效比较 (例)

3.5 两组不良反应发生率比较

由表7可见,两组患者不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。

表7 两组不良反应发生率比较 (例)

4 讨论

类风湿关节炎主要以小关节发病为主,临床发病机制不明确,属中医学“痹证”“历节风”范畴。该病病程较长,中医学认为发病原因为患者正气不足,风寒湿热等侵袭机体,导致关节肌肉麻木、屈伸不利,出现变形,对此病进行及时的治疗可有效控制其发展[7-9]。

人体重要的免疫抗体为IgA、IgG、IgM。IgA为参与黏膜局部免疫的抗体,IgG为机体免疫应答的抗体,IgM为体液免疫的最早抗体。IgA、IgG和IgM水平异常升高可导致机体体液免疫紊乱,且参与类风湿关节炎的发生[10-12]。本研究通过检测患者血清IgA、IgG和IgM水平评估患者的免疫反应,结果表明温针灸联合桂枝芍药知母汤治疗类风湿关节炎可降低患者 IgA、IgG和IgM水平,使患者的免疫反应得到调节,有助于病情恢复。在关节炎症反应中TNF-α、IL-37和IL-6发挥重要作用[13-15]。IL-37为炎症免疫抑制剂,在炎症反应时表达升高;TNF-α在炎症反应中作用较为关键,随着病情的发展而升高。本研究结果表明,治疗后类风湿关节炎患者血清中TNF-α、IL-37和IL-6水平降低,表明温针灸联合桂枝芍药知母汤治疗可抑制炎症溢出,调节患者的免疫功能,并降低骨关节损伤发生。

miRNAs长度为22个小核苷酸,来源于内源染色体的非编码单链 RNA,具有高度保守性,在多个细胞的迁移、侵袭、凋亡中发挥着作用,稳定存在于多种组织与细胞,miRNAs可与靶mRNA特异性的碱基配对,使其降解,并调控基因进行转录表达[16-17]。研究[18]表明,miRNAs为治疗自身免疫性疾病的靶点,与类风湿关节炎的发生、发展存在着密切的关系,miR-335位于7q32.2上,具有调节细胞增殖迁移与分化的作用,miR在进化上高度保守,并具有严格的组织及时序特异性,异常表达时可促进疾病的发生。研究[19]表明,miR-335可调节骨动态平衡,miR-335-5p与类风湿关节炎发展密切,在类风湿关节炎的发展中起抑制作用。临床研究[20]显示,miR-335-5p可靶向于多种mRNA的表达,可通过靶向 ICAM-1使甲状腺癌细胞的侵袭与转移受到抑制,还可通过靶向BCL2L2使顺铂对卵巢癌的敏感性提高,且miR-335-5p可下调LDHB使直肠癌的细胞的增殖与侵袭受到抑制。本研究结果显示,治疗后 miR-335-5p表达升高,表明温针灸联合桂枝芍药知母汤可抑制关节炎的发展,其可能为类风湿关节炎的保护基因。miR-141表达与软骨组织,可减少成骨表达与成骨作用,与骨细胞的代谢生长、肿瘤与炎症关系密切,miR-141在非酒精脂肪肝进展中表达升高,降低其表达可减少脂肪肝变性与炎症反应[21]。miR-141表达升高可使类风湿关节炎患者的炎性反应与成骨细胞的代谢受到影响,促进类风湿关节炎的发生与发展。本研究表明,温针灸联合桂枝芍药知母汤可使 miR-141在类风湿关节炎患者中表达降低,表明联合治疗可使其炎症的溢出受到抑制,调节患者的免疫功能,并降低骨关节损伤发生。本研究对联合治疗的具体作用机制并未深入研究,有待进一步研究。

综上所述,在常规治疗基础上,温针灸联合桂枝芍药知母汤治疗类风湿关节炎可减少关节压痛个数与关节肿胀个数,降低患者血清炎症因子水平,提高患者握力,可能与调控miR-335-5p和miR-141表达有关。