3种医院制剂的微生物限度方法验证

王一帆,夏 伟，贺 娟，李 春，陈 婷**

(1.昆明医科大学 药学院，云南 昆明 650000；2.中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院 药剂科，云南 昆明 650000；3.贵州医科大学神奇民族医药学院 药学系，贵州 贵阳 550000)

10%鱼肝油软膏、复方薄荷脑滴鼻剂和10%氯化钾溶液均收载于《解放军医疗机构制剂规范》(2015年版)。10%鱼肝油软膏主要功效是营养、润滑、保护和有助于肉芽组织生长，能促进烫伤、溃疡的伤口愈合，临床上用于改善慢性皮肤结核、外伤、烧烫伤、皲裂、鱼鳞病、溃疡及皮肤干燥等。复方薄荷脑滴鼻剂具有润湿和保护鼻腔黏膜、促进黏膜血液循环、刺激鼻腔黏膜细胞的再生功能的作用，临床上用于治疗干燥性鼻炎、萎缩性鼻炎、慢性鼻窦炎及过敏性鼻炎诱发的鼻腔黏膜糜烂。10%氯化钾溶液主要治疗低钾血症及洋地黄中毒引起的心率失常。

医院制剂是根据医院临床需要，由本单位配置的固定处方制剂，具有配置量少、使用周期短、能满足临床治疗需要、提高医院效益、推进合理化用药等优势。医院制剂要确保其质量稳定，其中的微生物限度检查就是制剂安全性检查的重要指标[1-2]。

为了确保建立的微生物方法适用于这3种医院制剂，现按照 2020 年版《中华人民共和国药典》第四部的要求，建立了10%鱼肝油软膏，复方薄荷脑滴鼻剂和10%氯化钾溶液的微生物计数法和控制菌检查法，并进行了方法适用性验证[3-5]。

1 微生物限度方法建立

1.1 仪器

洁净工作台(苏净集团安泰公司)；HPX-9082MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；MSL.N蒸汽灭菌器(威海威高海盛医用设备有限公司)；ME55/02型分析天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司，精度为十万分之一)

1.2 试药

10%鱼肝油软膏(批号为201105、201230、210201，规格均为 20 g/盒)，复方薄荷脑滴鼻剂(批号210706、210915、211116)，10%氯化钾溶液(批号210518、210804、211018)，均由解放军联勤保障部队第920医院所提供。

1.3 培养基

pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(Lot：317N031)、胰酪大豆胨液体培养基(Lot：108675)、胰酪大豆胨琼脂培养基(Lot:1090411)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(Lot:1082136)、溴化十六烷基三甲基铵琼脂培养基(Lot：1081174)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(Lot:1090021)、麦康凯琼脂培养基(Lot:108T031)、麦康凯液体培养基(Lot:317E031)，生产厂家均为广东环凯微生物科技有限公司。

1.4 菌种

①白色念珠菌[CMCC(F)98001]；②枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]；③黑曲霉[CMCC(F)98003]；④铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]；⑤金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；⑥大肠埃希菌[CMCC(B)44102]。均由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.5 方法

1.5.1 溶液制备

1)菌液制备

按2020版《中华人民共和国药典(四部)》通则1105项下方法制备菌液[6]。

2)供试液制备

10%氯化钾溶液供试品的制备：取10%氯化钾溶液 10 mL，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中(不超过 40 ℃)100 mL，混匀，制成 1∶10(体积比)的供试液；

10%鱼肝油软膏供试品的制备：取10%鱼肝油软膏 10 g，加入 20 mL 无菌十四烷基异丙酯和无菌玻璃珠的三角瓶中，振摇，混匀。再加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(45 ℃)100 mL，振摇，混匀，然后倒入分液漏斗中，静置一段时间，待油水分层后，取水层作为1∶10的供试液[7]。

复方薄荷脑滴鼻液供试品的制备：取复方薄荷脑滴鼻液 10 mL，加入 10 mL 无菌十四烷基异丙酯溶液和无菌玻璃珠到三角瓶中,振摇，混匀。再加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(45 ℃)100 mL，振摇，混匀，然后倒入分液漏斗中，静置一段时间，待油水分层后，取水层作为1∶10的供试液。

1.5.2 细菌、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

试验组：取1.5.1中2)项下的供试液 9.9 mL，每批5份，每份加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌及黑曲霉菌的菌液 0.1 mL,使供试液每 1 mL 含菌量不大于 100 CFU。混匀，吸取各染菌供试液 1 mL，分别注入平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每份平行制备2个平板，待凝固后，35 ℃ 培养 3 d，测定需氧菌总数；取1.5.1中2)项下的供试液 9.9 mL，每批2份，每份加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌液 0.1 mL，使供试液每 1 mL 含菌量不大于 100 CFU。混匀，吸取各染菌供试液 1 mL 注入平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每份平行制备2个平板，待凝固后，25 ℃ 培养 5 d，测定霉菌及酵母菌总数[8-15]。

阳性对照组：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，同试验组操作。

供试品组：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作。

稀释剂组：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液、菌液，同试验组操作。

验证试验分3次独立完成，各试验组分别采用上述方法平行做3次。

计算: 细菌、霉菌和酵母菌总数的回收率

计算公式：回收比值=(试验组平均菌落数-供试品组平均菌落数)/阳性对照组的平均菌落数。

1.5.3 控制菌检查方法适用性

根据2020版药典四部通则1107规定，皮肤给药制剂的控制菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，鼻用制剂的控制菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌，口服制剂控制菌为大肠埃希菌[6-15]。

1)金黄色葡萄糖球菌

试验菌组：取1.5.1中2)项下的1∶10的供试液 10 mL 两份，分别加入含菌量不大于 100 CFU 的金黄色葡萄球菌菌液及含菌量不大于 100 CFU 大肠埃希菌菌液，混匀。加入胰酪大豆胨液体培养基 100 mL 中，35 ℃ 培养 24 h。

阳性对照组：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，同试验组操作。

供试品组：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作。

阴性对照组：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液、菌液，同试验组操作。

选择与分离培养：取上述试验中的液体培养基，接种到甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，再在 35 ℃ 的恒温培养箱里培养 24 h。

结果判断：在平板上，如果没有金黄色葡萄糖球菌菌落的特征，则判定为未检出，且大肠埃希菌在甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上不生长。

2)铜绿假单胞菌

用铜绿假单胞菌替代1.5.3中1)项中的金黄色葡萄球菌，分组和操作同1.5.3中1)项金黄色葡萄糖球菌的操作。

选择与分离培养：取上述试验中的液体培养基，划线到溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，再在 35 ℃ 的恒温培养箱里培养 24 h。

氧化酶试验：将无菌的滤纸片放在平皿上，用玻璃棒在上述平板蘸取生长的菌落涂于滤纸片上，随后滴加2滴的新配制的1%二盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液，若在 30 s 内培养物变成粉红色并且逐渐变紫红色，则可以判定为氧化酶试验阳性，反之则为阴性[16]。

结果判断：如果未出现铜绿假单胞菌的特征，则判定为未检出，且大肠埃希菌在溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上不生长。

3)大肠埃希菌

试验菌株组：取1.5.1中2)项下的1∶10的供试液 10 mL 两份，分别加入含菌量不大于 100 CFU 的大肠埃希菌的菌液及含菌量不大于 100 CFU 金黄色葡萄球菌的菌液，混匀。加入胰酪大豆胨液体培养基 100 mL 中，35 ℃ 培养 24 h。

选择与分离培养：取上述培养物 1 mL 接种至 100 mL 麦康凯液体培养基中，42～44 ℃ 培养 24～48 h。金黄色葡萄球菌接种到麦康凯液体培养基上，不生长。取麦康凯液体培养基培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，35 ℃ 培养18～72 h。

结果判断：如果未出现大肠埃希菌的特征，则判定为未检出，且金黄色葡萄球菌在麦康凯琼脂培养基平板上不生长。

1.5.4 细菌、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验结果

细菌、霉菌和酵母菌的回收率均在0.5～2.0之间，同时稀释剂组无菌生长，说明方法可行(见表1、表2)。

表1 需氧菌总验证回收比值

表2 霉菌和酵母菌验证回收比值

1.5.5 控制菌检查方法适用性结果

在控制菌检查方法适用性试验中，试验组能够检出所加试验菌相应反应特征，同时阴性对照均无菌生长，说明方法可行(见表3)。

表3 控制菌检查结果

2 讨论

药品检验是保障药品质量和安全性的重要关卡，微生物检验又是其中一项重要措施。本研究建立了10%鱼肝油软膏、复方薄荷脑滴鼻剂和10%氯化钾溶液的微生物限度检查方法。针对不同制剂类型采用不同的试验方法，能精准消除一些干扰因素，使操作简捷，结果精确，提高了医院制剂的检测质量，也为相似制剂的微生物限度检查方法适用性试验提供了参考。

微生物污染，会造成制剂的变质、失效，甚至会产生毒性。而污染原因可能有以下几种情况：①原料药:一般购入的原料药都是符合规定的，但不能排除在运输、储存时污染；②操作环境及操作人员的卫生情况；③容器及包材。通过微生物限度检查，严格控制院内制剂的质量安全，加强医院制剂生产各个环节的管控，从根源上避免污染的情况，确保医院制剂的疗效和用药安全。

3 结语

本试验中测需氧菌、霉菌及酵母菌总数的验证时采用1∶10的供试液加菌回收比值均落在0.5～2.0的范围内，测控制菌的检测方法验证时，试验组和菌液组对应菌株生长良好，阴性对照组、供试品组和试验菌株组无菌生长，故这3种医院制剂都采用常规法进行检验。2020版《中华人民共和国药典》对的油脂类供试品的处理方法是取供试品，添加灭菌的十四烷酸异丙酯。十四烷基异丙酯满足药典要求，能溶解分散疏水性的制剂，且本身没有抑菌活性，还能消除制剂中的一些抑菌成分。这种化学助溶方法，较水浴加热助溶法更易操作，步骤简单。所以在本试验中，10%鱼肝油软膏和复方薄荷脑滴鼻剂的供试品处理中，都加入了十四烷酸异丙酯。前处理中，还用到了无菌玻璃珠让溶液混合得更加均匀，加上分液漏斗的萃取，使供试品提取得更加完全。这些创新的处理方法为供试品处理方法提供了新思路，找寻高效简便及符合药典规定的试验方法是很有必要的。