草乌甲素闪式提取工艺优化及热稳定性研究

付彬彬，龚云麒，周 剑，刘建文，刘军锋

(昆药集团股份有限公司，云南 昆明 650021)

草乌甲素(Bulleyaconitine A，分子式C35H49NO10，相对分子质量643.76)，又名滇西嘟拉碱甲，为白色结晶或结晶性粉末，最早是从毛莨科乌头属植物滇西嘟拉(aconitum bulleyanum diels)中分离出的一种具有生物活性的生物碱[1-2]。因具有较强的镇痛及免疫调节等药理活性，草乌甲素现如今作为一种现代植物药，广泛应用于风湿性及类风湿性关节炎、骨关节炎、腰肌劳损、肩周炎、四肢扭伤等的治疗[3-7]。草乌甲素具有镇痛时间长，副作用小，疗效明确，且对器官无明显损伤等特点。相比于传统的镇痛药，草乌甲素没有阿片类镇痛药的成瘾性及耐受性等副作用，也没有非甾体消炎药类镇痛药的胃肠道损伤、出血及肾毒性等不良反应[8]。

近年来，草乌甲素及其制剂在疼痛治疗领域的临床价值不断被认可，连续列入了带状疱疹后神经痛、神经病理性疼痛、腰背痛全国专家共识推荐用药。随着草乌甲素制剂在疼痛病领域的广泛应用，草乌甲素原料药的需求也在不断增加。现如今，草乌甲素原料药主要来源于乌头属类植物的提取分离。因此，通过草乌甲素闪式提取工艺优化及热稳定性研究，为草乌甲素的提取纯化工艺水平的提升提供科学依据。

闪式提取是一种新型提取方法，具有提取速度快、提取时间短、有效成分破坏少等优点[9]，其原理是物料在提取器内通过高速粉碎、快速搅拌、高速振动等方式使有效成分迅速达到组织内外平衡[10]。此次试验以长喙乌头粗粉为原料，探究长喙乌头闪式提取最佳工艺条件及对提取液的热稳定性进行考察。

1 实验材料与仪器

高效液相色谱仪(LC-2030C，日本岛津)；JHBE-50T闪式提取器(河南智晶生物科技)；BP221S型分析天平(北京赛多利斯仪器公司)；HWS12型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；DFY-1000D型高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。

长喙乌头(丽江永胜)，草乌甲素对照品(中国药品生物制品检定所)，乙腈(色谱级，上海星可)，磷酸(色谱级，阿拉丁)，乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6ID×250 mm)，0.2%三乙胺水溶液(用磷酸调节pH值至3.1±0.1)-乙腈(65∶35)为流动相;流速 1.0 mL/min;检测波长 260 nm; 柱温 25 ℃；进样量:10 μL；理论塔板数按草乌甲素峰计算应不低于3000[11]。色谱图见图1、图2。

图1 草乌甲素对照品色谱图

图2 长喙乌头药材色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取草乌甲素对照品 11.5 mg，置于 100 mL 量瓶中，加少量 0.1 mol/L 盐酸溶解后，加水稀释制成 40 μg/mL 草乌甲素，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

准确称取本品粗粉 0.5 g，置予具塞锥形瓶中，加入50%甲醇 50 mL，称定质量，超声处理(功率 250 W，频率 35 kHz )30 min，放冷，再称定质量。用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取过滤液，作为供试品溶液。

2.4 仪器精密度试验

以同一份对照品溶液连续进样7次，草乌甲素峰平均保留时间为 12.64 min，RSD=0.36%；平均峰面积697.66，RSD=0.16%。表明仪器重复性好。

2.5 稳定性试验

草乌甲素对照品溶液在 0、2、4、8、12、24、48 h 时分别测定，以峰面积计算RSD，为0.28%。结果表明，草乌甲素溶液在 48 h 内稳定。

2.6 标准曲线

精密称取草乌甲素对照品 20.8 mg，加 0.1 mol/L 盐酸溶解后，加水稀释定容至 100 mL 容量瓶中，制成储备液(0.208 mg/mL)。分别精密量取储备液2.5、3.5、4.0、5.0、5.5、6.5、7.5 mL，分别置予 25 mL 量瓶中，加水稀释制成一系列梯度浓度的溶液。分别取 10 μL 进高效液相色谱仪，波长 260 nm 处测定峰面积，以草乌甲素的质量浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归计算。线性回归方程为：Y=17.244X-8.820，r=0.9998(n=7)。结果表明，草乌甲素在 20.8～62.4 μg/mL 范围内，峰面积和质量浓度呈良好线性。

3 正交试验设计提取工艺

3.1 因素水平设计

根据文献研究和预实验，分别考虑乙醇质量分数、料液比例、提取时间、提取次数为影响因素，采用L9(34)正交试验设计，以草乌甲素提取率为考察指标，确定正交试验的最佳试验方案。见表1。

3.2 正交试验结果

正交试验结果详见表2、表3。

表2 闪式提取法正交试验设计及结果

表3 闪式提取的方差分析

由草乌甲素方差分析(表3)得出：提取次数(D)与料液比(B)有显著性，为显著因素。直观分析四个影响因素大小顺序为D>B>C>A；其中A2> A1> A3；B3> B2> B1；C3> C1> C2;D3> D2> D1。根据实验结果，长喙乌头中草乌甲素闪式提取方案应为A2B3C3D3。即：70%乙醇，料液比 1∶8 g/mL，提取时间 30 min，提取4次。

3.3 验证性实验

如表4所示，采用正交试验优化出的长喙乌头闪式提取最佳方案，重复实验3次，得到平均提取率为93.08%，均高于正交实验9次结果，证明优选出的长喙乌头闪式提取工艺效率高、稳定、可靠。

表4 验证性实验结果

4 长喙乌头提取液热稳定性的考察

将上述验证性实验得到的长喙乌头闪式提取液(20201215批)置于 10 mL 容量瓶中，定容，置于一定温度(恒温)水浴锅内静置保温，分别在 0、1、2、4、8、12、24 h 时取出一个容量瓶，冷却至室温，用75%乙醇补充损失体积，重新定容。其中，水浴温度为 70 ℃、75 ℃、78 ℃。高效液相色谱法检测每份容量瓶中草乌甲素的质量浓度，结果如表5所示。

表5 长喙乌头提取热稳定性考察结果

将表5中实验结果以时间为横坐标，草乌甲素质量浓度为纵坐标，绘制出草乌甲素在一定温度下质量浓度随时间变化的趋势图，如图3所示。

图3 草乌甲素热稳定性趋势图

从图3中看出，草乌甲素的质量浓度随着水浴时间和水浴温度的增加逐渐降低，在 78 ℃ 条件下，草乌甲素的质量浓度在 24 h 内下降了85.7%，说明提取液中的草乌甲素具有热不稳定性，不能长久置于高温(≥70 ℃)环境中。但从数据也可知，提取液在 75 ℃ 以下环境中，0～4 h 内草乌甲素的质量浓度变化不大，为可控范围。

5 结论

本实验以乙醇质量分数、料液比例、提取时间、提取次数为考察对象，正交实验设计得到长喙乌头闪式提取最佳工艺参数，即：乙醇质量分数70%，料液比例 1∶8 mg/L，提取时间 30 min，提取次数4次。重复验证最佳工艺参数的草乌甲素提取率为93.08%,说明优选出的长喙乌头闪式提取工艺效率高、稳定、可靠。长喙乌头提取液热稳定性考察，说明提取液中的草乌甲素具有热不稳定性，不能长久置于高温(≥70 ℃)环境中。

研究结果提示，在提取、浓缩等工艺步骤中，应控制温度及加热时间，以避免草乌甲素降解，闪式提取法因提取时间短、效率高、提取温度低等优点，在草乌甲素的提取上具有一定的推广意义。