PD-1及TIM-3在早期宫颈癌患者中的表达及与生存预后的关系研究

刘苗苗，刘辉辉，贺丽亚，彭丽丽，崔玉洁，王 霞，张洪珍

(1. 河北省人民医院，河北 石家庄 050051；2. 河北省血液中心，河北 石家庄 050004)

宫颈癌是女性常见的癌种之一，人乳头瘤病毒感染与其发生有关，机制可能与T细胞对人乳头瘤病毒感染的抑制作用降低有关[1]。虽然人乳头瘤病毒疫苗已在宫颈癌预防方面获得了一定的成效，但宫颈癌的发病率及病死率仍呈上升趋势。手术是治疗早期宫颈癌的主要方法，但仍有很大比例的患者会发生局部或远处复发，对于晚期宫颈癌患者主要采用放疗和化疗，这些治疗方法收效甚微。免疫检查点抑制剂是宫颈癌的潜在治疗药物，其中程序性死亡受体1(programmed death 1,PD-1)抑制剂中的Pembrolizumab已经FDA批准用于宫颈癌的治疗[2]，其他免疫检查点抑制剂正在进行多项临床试验中。若发现T细胞上额外的免疫抑制受体，将会为宫颈癌患者的治疗带来更多的选择。T细胞免疫球蛋白黏液素3(T-cell immunoglobulin mucin-3,TIM-3)作为T细胞上的抑制性受体于2002年首次被发现，其是一类表达于活化的T细胞表面的抑制性分子,能引起癌症感染过程中T细胞的衰竭[3]。而PD-1是早期发现的耗竭T细胞的标志物，两者共表达抑制T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的能力更强，两者在肿瘤微环境中免疫抑制环境的形成中起着重要的作用[4]。目前研究认为，抗PD-1免疫治疗发生耐药的原因是发生免疫逃逸，主要机制可能是选择性激活了TIM-3，因此TIM-3抑制剂的出现是PD-1抑制剂出现耐药后患者治疗的重要补充[5]。本研究探讨了PD-1、TIM-3在宫颈癌组织中的表达情况及二者之间和患者临床病理特征的关系，旨在进一步明确PD-1、TIM-3在宫颈癌发病中的作用，为免疫检查点抑制剂在宫颈癌中的合理应用提供证据支持。

习近平总书记指出,我国生态环境质量持续好转,出现了稳中向好态势,但成效并不稳固。经济新常态(增速上的放缓)某种程度上为环保工作创造了重要的“窗口期”;市场出现饱和(产能过剩)为我们在环境保护上提出较高要求和标准创造了条件;财力增长、技术进步和经验积累使我们有能力和条件解决生态环境问题。[注]庄贵阳、薄凡:《厚植生态文明 耕耘美丽中国——“形势与政策”专题讲稿》,《时事报告·大学生版》(增刊),2018年8月,第86-99页。

1 资料与方法

1.1纳入标准 经病理诊断明确的初治宫颈癌患者；经腔镜下广泛性子宫切除术+双侧附件切除+盆腔、腹主动脉旁淋巴结切除术的手术治疗者，且未接受术前新辅助放化疗；临床分期Ⅰ～ⅡA1期；治疗前均已完善血液学指标检查、影像评估，临床资料完整；可随访到患者无进展生存期、总生存期。

1.2排除标准 病理诊断不明确或合并其他肿瘤者；非人乳头瘤病毒感染患者；采用其他术式治疗者；有甲亢、糖尿病、心脏病及类风湿免疫性疾病等重大疾病者。

1.3一般资料 收集2016年1月1日—6月30日在河北省人民医院初治的45例早期宫颈癌患者术后病理标本及临床资料，根据2014年世界卫生组织(WHO)子宫颈肿瘤组织学分类进行病理学诊断，根据2015年FIGO分期进行肿瘤分期。治疗结束后通过门诊复查、电话或短信随访等形式进行随访，随访内容包括患者的一般情况及复发进展状况、生存结局等，随访截止时间为2020年4月1日。无病生存时间定义为从患者接受治疗至肿瘤复发的时间，随访生存时间定义为患者从治疗开始到死亡或最后一次随访的时间。本研究已通过河北省人民医院医学伦理委员会审核[(2019)科研伦审第(33)号]。

2.4影响患者预后的单因素分析 单因素分析显示患者的肿瘤分化程度、是否发生淋巴结转移、PD-1和TIM-3阳性表达情况与患者的无病生存期有明显相关性(P均<0.05)，患者的年龄、肿瘤分化程度、是否发生淋巴结转移、PD-1和TIM-3阳性表达情况与患者的随访生存时间有明显相关性(P均<0.05)。见表2。

就业关系到国计民生，直接影响社会稳定。中国由于经济结构调整，面临较大的就业压力。而旅游业是一个劳动密集型产业，在缓解就业压力方面起着重要作用。在旅游就业中，由于旅游非正规就业对教育和技能水平的要求不高，因此在吸收城镇失业人口和农村剩余劳动力方面发挥着重要的作用，而在旅游非正规就业中，存在着一种规模较大但又经常被人们忽视的就业类型——自我就业。

1.5宫颈癌组织中PD-1和TIM-3表达检测

2.5COX风险比例回归模型多因素分析 对单因素分析有统计学意义的指标进行多因素分析，显示分化程度是患者无病生存期和随访生存时间的独立影响因素(P=0.029，P=0.047)，是否淋巴结转移、PD-1和TIM-3是否阳性与患者的无病生存期和随访生存时间均无明显相关性(P均>0.05)。见表3及表4。

1.5.2检测方法 宫颈癌组织标本均4 μm厚连续切片，按常规方法融蜡、脱蜡、水化，枸橼酸盐缓冲液抗原修复，自然冷却至室温，用PBS洗片3 min×3次；将切片浸于3%H2O2中，37 ℃孵育20 min，避光保存，PBS洗片3次，各5 min；一抗孵育：在切片中分别加入稀释好的鼠抗人PD-1单克隆抗体(1∶100)、兔抗人TIM-3多克隆抗体(1∶100)，置于4 ℃冰箱过夜；二抗孵育：切片从冰箱取出，室温放置60 min，PBS洗片5 min×3次，加入二抗(被生物素标记)，37 ℃孵育30 min；再次用PBS清洗切片5 min×3次，加适量DAB配液，根据显色程度，适时用蒸馏水阻断显色；苏木精复染；再脱水，滴适量中性树胶在切片上，轻压盖玻片，排出气泡。每张切片随机挑选5个高倍镜视野(×400)观察细胞染色情况。

2.2不同TIM-3组和PD-1组患者临床病理特征间的关系 TIM-3阳性组和TIM-3阴性组比较、PD-1阳性组与PD-1阴性组比较，肿瘤分化程度、是否发生淋巴结转移差异均有统计学意义(P均<0.05)，年龄、是否绝经、病理类型、人乳头瘤病毒感染类型、临床分期、体质指数差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

1.6统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行数据统计分析。不同组间患者临床病理特征的比较采用卡方检验或Fisher精确检验，使用Graphpad 8.0.2绘制生存率曲线，采用log-rank检验进行预后单因素分析,采用COX风险比例回归模型进行预后多因素分析，相关性分析应用Pearson检验。取α=0.05为检验水准，双侧P值，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PD-1、TIM-3在宫颈癌组织中的表达情况宫颈癌组织中PD-1蛋白阳性表达率为73.3%(33/45),TIM-3蛋白阳性表达率为64.4%(29/45)。PD-1阳性表达主要定位于宫颈癌细胞和间质淋巴细胞的细胞质和细胞膜；在鳞状细胞癌和腺癌中的表达位置并不完全一致,PD-1蛋白主要表达于腺癌肿瘤细胞膜, 而在鳞状细胞癌中表达于肿瘤细胞胞质和胞核。TIM-3蛋白主要表达于宫颈癌细胞的胞质中，表现为棕褐色着色，少数细胞胞核也可见着色。见图1。

1.4研究方法 采集患者的一般资料，主要包括年龄(年龄分组以患者的年龄的平均值为界)、体质指数(体质指数<18 kg/m2为体重过低，18 kg/m2≤体质指数<24 kg/m2为体重正常，24 kg/m2≤体质指数<28 kg/m2为超重，体质指数≥28 kg/m2为肥胖)、病理类型、分化程度、临床分期、人乳头瘤病毒感染情况、绝经情况、淋巴结转移情况。采用免疫组织化学法检测宫颈癌组织样本中PD-1和TIM-3的表达情况，按照PD-1和TIM-3表达情况分为PD-1阳性组、PD-1阴性组、TIM-3阳性组、TIM-3阴性组，比较各组临床病理特征及随访1～4年的生存率，对预后影响因素进行单因素和多因素分析，对PD-1和TIM-3的关系及各因素与二者的关系进行相关性分析。

1.5.3阳性判定标准 PD-1判定标准:参考Meng等[6]研究进行阳性结果的判定，细胞染色强度分为4个等级：细胞周围、边缘或其中有大量着色(强阳性)得分为3分； 细胞周围、边缘或其中中等着色(中度阳性)得分为2分；细胞周围、边缘或其中少量着色(弱阳性)得分为1分；细胞周围、边缘或其中没有着色，或者只是肿瘤细胞自身被染色(阴性)得分为0分。阳性细胞率=阴性区域的百分比×0+弱阳性区域的百分比×1+中度阳性区域的百分比×2+强阳性区域的百分比×3。TIM-3判定标准:参考Cao等[7]研究进行阳性结果的判定，以染色强度结合染色阳性细胞数所占百分比进行综合评分。细胞染色强度分为无色(0)、弱(1)、中(2)、强(3)4个等级，阳性细胞所占的百分比称为表达分数。表达分数与强度得分相乘即为综合评分，评分范围0～3分，0～1分为TIM-3阴性表达，否则为阳性表达。以上所有结果均由2位经验丰富的病理科医师在双盲的情况下统计所得。

图1 PD-1和TIM-3在宫颈癌组织中阳性表达情况(免疫组化染色，×400)

2.6PD-1和TIM-3的相关性及各因素与二者的相关性 PD-1和TIM-3表达呈正相关(r=0.497，P=0.001)；PD-1和TIM-3与肿瘤分化程度均呈正相关(r=0.400，P=0.006；r=0.396，P=0.007)，与是否淋巴结转移均呈负相关(r=-0.312，P=0.037；r=-0.035，P=0.017)。见表5。

在城市水环境的治理工作中，基础内容为在源头进行合理的治理，确保河流源头的污染源被有效控制，从而确保源头水资源的质量。在河流源头的污染等问题得到控制后，城市河流的净化功能与基础处理功能等会逐渐恢复，不会继续影响河流的水环境，而河流生态结构的破坏因素也能得到有效控制。在源头治理工作中，主要工作内容为控制水体污染负荷及浓度，确保汇往城市河流的水的各项指标符合相关标准。

为了更直观的看出地壳的变化，结合前人的研究结果，绘制了研究区域的等值线图。由图8可见，处于青藏高原的东南端以及云贵高原处川西和云南地区的地壳厚度较大，并且自西向东逐渐减小，到了四川盆地处以及重庆荣昌地区接近于最小值，再向东延伸，地壳厚度又开始有所增大[15]。

1.5.1主要仪器和试剂 烤箱、金属架、微量加样器、湿盒、计时器、搅拌器、灰盒、通风厨、冰箱、电磁炉、EP管、高压锅、盖玻片、滴管、电子显微镜及图像采集系统、全自动数字切片扫描仪均来源于河北省人民医院病理科。 兔抗人TIM-3多克隆抗体(英国ABcam公司),鼠抗人PD-1单克隆抗体(英国ABcam公司),免疫组化SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),枸橼酸缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司，pH值6.0)，封闭血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)，二甲苯、中性树胶、梯度乙醇、3%过氧化氢(H2O2)、蒸馏水、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、苏木精、氨水、盐酸(HCl)。

2.3不同PD-1组和TIM-3组患者预后比较本研究45例宫颈癌患者中位无病生存期为36个月，中位随访生存时间为46个月。PD-1阴性组与PD-1阳性组的无病生存期的1年、2年、3年、4年的生存率分别为100%，100%，91.67%，66.67%和100%，81.82%，42.42%，21.21%；PD-1阴性组与阳性组的4年随访生存时间的生存率分别为100%，100%，100%，66.67%和100%，100%，87.88%，27.27%。通过log-rank检验，PD-1阴性组的中位无病生存期、中位随访生存时间均明显长于PD-1阳性组(P=0.048 4，P=0.045 0)；TIM-3阴性组与TIM-3阳性组的无病生存期的1年、2年、3年、4年的生存率分别为100%，100%，87.5%，50%和96.55%，79.31%，34.03%，24.14%；TIM-3阴性组与阳性组的4年随访生存时间的生存率分别为100%，100%，100%，62.5%和100%，100%，86.21%，24.14%。通过log-rank检验，TIM-3阴性组的中位无病生存期、中位的随访生存时间均明显长于TIM-3阳性组(P=0.016 0，P=0.016 6)。生存率曲线见图2。

3 讨 论

目前研究发现，PD-1在非小细胞肺癌、肾癌和乳腺癌等在内的多种恶性肿瘤中均有高表达，且其表达量与存活率呈负相关[8-10]。TIM-3作为一种新的免疫检查点受体, 它在肿瘤干细胞和骨髓细胞中可诱导T细胞衰竭并抑制抗肿瘤的免疫作用[11]。T细胞能对病毒和癌细胞进行识别和清除，但若被持续的抗原刺激和在肿瘤微环境中释放的免疫抑制介质破坏，导致T细胞处于一种功能失调的状态，称为T细胞耗竭，这种状态将无法抑制病毒或癌症[12-13]。Kuai等[14]研究报道，PD-1和TIM-3是重要的免疫抑制因子，在肿瘤免疫逃逸和癌症进展中发挥着重要作用，影响多种肿瘤患者的预后。

选取最优的CNN模型与传统模型评测结果绘制P-R曲线和ROC曲线，其中图8为各模型P-R曲线对比图，图9为各模型ROC曲线对比图。

表1 不同TIM-3组和PD-1组宫颈癌患者临床病理特征的关系 例

图2 不同PD-1组和TIM-3组宫颈癌患者无病生存期、随访生存时间曲线

表2 45例宫颈癌患者无病生存期、随访生存时间单因素分析

表3 45例宫颈癌患者无病生存期的多因素分析

表4 45例宫颈癌患者随访生存时间的多因素分析

表5 45例宫颈癌患者临床病理特征各因素与PD-1和TIM-3的相关性

本研究结果显示，宫颈癌组织中PD-1蛋白阳性表达率为73.3% , TIM-3蛋白阳性表达率为64.4%，证实早期宫颈癌患者多数存在PD-1和TIM-3表达；且PD-1和TIM-3表达与肿瘤的分化程度、是否淋巴结转移具有相关性，分化程度越低，出现淋巴结转移，则PD-1和TIM-3阳性的可能性越大。结果与文献[7,15-16]研究结果相似。通过生存曲线发现, PD-1和TIM-3阳性患者预示着较差的疾病转归，更容易出现复发或转移；相关性分析显示，PD-1和TIM-3的表达呈正相关，PD-1和TIM-3与肿瘤分化程度均呈正相关，与是否淋巴结转移均呈负相关，提示二者表达水平可能有助于判断宫颈癌的发生发展情况，且TIM-3似乎比PD-1可更好地预测宫颈癌患者的预后，可能为宫颈癌的肿瘤免疫治疗提供新的思路和靶点。但本研究样本量较小，可能存在选择偏倚；随访时间相对较短，大多数患者尚未到达最终总生存期时间；仅采用免疫组化方法检测宫颈癌组织中PD-1和TIM-3的表达情况。故有待扩大样本量，采用不同方法鉴定宫颈癌组织中PD-1和TIM-3表达的细胞位置等深入研究。

从模型来看，地方感的3个维度之间呈显著正相关，具有较强的相互影响，且对身份认同与融合的作用存在差异。地方依恋和地方认同对身份认同与融合的直接贡献为正，而地方满意度对身份认同与融合的直接影响为负。

综上，早期宫颈癌患者PD-1和TIM-3阳性表达率较高，二者表达上调可能预示着易发生复发转移和可能较差的生存结局；在未来，TIM-3抑制剂对宫颈癌免疫治疗方面或许能占据不可或缺的地位。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。