姜黄素抑制涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭、转移的作用及相关机制研究

蒋烈浩，许世莹，钱晨宏，谭 卓，周 政，郑国湾，葛明华,王佳峰

(1. 浙江省人民医院(杭州医学院附属人民医院)，浙江 杭州 310014；2. 浙江省内分泌腺体疾病诊治研究重点实验室，浙江 杭州 310014；3. 浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053；4. 蚌埠医学院研究生院，安徽 蚌埠 233030)

涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)又称为唾液腺腺样囊性癌，是常见的头颈部恶性肿瘤之一，早期以无痛性肿块多见,具有生长缓慢、嗜神经侵袭性较强、易发生远处转移等特点[1]。SACC早期治疗以手术切除为主，伴有淋巴结转移和远处转移者预后较差，因此中晚期和复发患者以放化疗、靶向治疗配以中药调节免疫力的综合治疗为主。姜黄素是从姜黄中提取的一种多酚物质，其可以促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移[2-3]。目前姜黄素对SACC细胞的调控作用及相关机制仍未十分明确，因此本研究以人源涎腺腺样囊性癌高转移株SACC-LM细胞株为研究对象，初步观察了姜黄素对SACC细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，并从JAK-STAT3信号通路角度探讨了其相关作用机制，以期为姜黄素用于SACC的治疗提供新的方向和思路。

1 实验材料与方法

1.1细胞株和药物 人源涎腺腺样囊性癌高转移株SACC-LM(北京大学口腔医学院李盛林教授惠赠)；姜黄素(中国Sigma-Aldrich公司，C1386)。

1.2试剂及仪器 胎牛血清(Fetal Bovine Serum/FBS，Sera&Pro公司，S601P-500)；RPMI-1640 Medium (with Penicillin-Streptomycin)(Biochannel，BC-M-016-500ml)；CCK-8试剂盒(中国碧云天生物技术研究所,C0037)；RIPA蛋白裂解液(中国碧云天生物技术研究所,P0013B)；PMSF (中国碧云天生物技术研究所,ST506)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天生物技术研究所,P0010S)；SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5×，还原型，中国碧云天生物技术研究所，P0015L)；一抗STAT3(英国Abcam公司，ab68153)，TIMP1(英国Abcam公司，ab211926)，SNAIL(英国Abcam公司，ab216347)，CyclinD1(英国Abcam公司，ab16663)，MMP-9(英国Abcam公司，ab76003)，MMP-2(英国Abcam公司，ab92536)，二抗羊抗兔IgG(英国Abcam公司，ab6721)，二抗羊抗鼠IgG(英国Abcam公司，ab6789)；AURAGENE ECL化学发光检测试剂盒(中国长沙艾佳生物公司，P001WB)；膜联蛋白 V/藻红蛋白(Annexin V-PE)细胞凋亡检测试剂盒(中国碧云天生物技术研究所，批号 C1065S)；蛋白电泳分子量300marker(美国Thermo公司，26634)、170marker(美国Thermo公司，26616)；Thermo scientific protein ladders(美国Thermo公司，26617)；流式细胞仪(美国安捷伦，Agilent Technologies)；凝胶成像系统(美国伯乐，Bio-Rad)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 用RPMI-1640+10%FBS+10%胎牛血清+1%双抗培养SACC-LM细胞株，置于37 ℃恒温恒湿、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞融合率达到约90%时进行传代培养，以1∶2的比例进行传代。

1.3.2细胞增殖活性检测 将对数生长期的SACC-LM细胞接种于96孔板中，每孔3 000个细胞，在接种12 h细胞贴壁生长后，将细胞暴露于含姜黄素浓度分别为0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L的培养基中，每个样本浓度6个复孔。处理72 h后，吸除原培养基，细胞中加100 μL含10%CCK-8的RPMI-1640培养基，培养箱静置2 h。利用紫外分光光度计于450 nm处检测细胞吸光度，计算细胞生长倍数。因为细胞生长在25 μmol/L浓度时发生了断崖式下跌，因此为了更加精确摸索姜黄素的适宜浓度，观察了姜黄素0μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L处理72 h后的细胞形态。同样方法检测SACC-LM细胞暴露于含姜黄素浓度分别为0 μmol/L、10 μmol/L的培养基中24 h、48 h、72 h、96 h的吸光度，计算细胞生长倍数，绘制生长曲线。

1.3.3细胞侵袭能力Transwell检测 实验分为姜黄素0μmol/L组、姜黄素1μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组，各组分别用相应浓度的姜黄素培养液处理SACC-LM细胞72 h，用无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞，制备细胞悬液，按50 个/μL浓度稀释，接种到铺有基质胶的Transwell小室内，每个小室加500 μL细胞悬液，下层的24孔板中加入750 μL含10%FBS的1640培养液，每组3个复孔，置于37 ℃培养箱中培养48 h；然后用无菌棉签轻轻擦去Matrigel基质胶和上室未侵袭的细胞，用0.5%结晶紫对侵袭细胞染色，于显微镜下计数每组侵袭的细胞，并拍照。

1.3.4细胞迁移能力划痕实验检测 实验分为姜黄素0μmol/L组、姜黄素1μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组，各组分别用相应浓度的姜黄素培养液处理SACC-LM细胞72 h后，将细胞以80万个/孔接种于6孔板，每组3个复孔。待细胞贴壁后用10 μL枪头垂直于培养板背面的直线做划痕处理，弃去培养基后，用PBS洗去被划下的细胞，记录划痕宽度，并加入无血清1640培养基继续培养，每隔12 h同一位置连续拍照记录各组细胞划痕宽度，计算单位长度内跨过划痕线的细胞数目。

1.3.5细胞凋亡流式细胞检测 实验分为姜黄素0 μmol/L组、姜黄素1 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组，各组分别用相应浓度的姜黄素培养液处理SACC-LM细胞72 h后,将细胞重悬于195 μL的Binding Buffer中，吹打混匀后再转移至5 mL的流式管中；把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞1次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液，需避免胰酶的过度消化；取细胞悬液，4 ℃下1 000 r/min离心5 min,弃上清；加入1 mL预冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮,4 ℃下1 000 r/min离心5 min，弃上清；加入200 μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL 7-AAD 混匀；室温、避光、反应5 min；加入1 μL Annexin V-PE染液，混匀；室温、避光、反应15 min；流式细胞仪检测细胞凋亡情况，每个样品以流式细胞仪采集约10 000个细胞,右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为中晚期凋亡及死亡细胞。使用CXP分析软件进行分析。

1.3.6JAK-STAT3信号通路相关因子蛋白表达Western blot检测 实验分为姜黄素0 μmol/L组和姜黄素10 μmol/L组，分别用相应浓度的姜黄素培养液处理SACC-LM细胞72 h后,收集SACC-LM细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。将蛋白浓度调至一致后，每组每孔上样10 μg蛋白，用10%的SDS-PAGE将蛋白质分离，截取目的蛋白并转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h或4 ℃过夜，随后加入所需浓度的一抗于4 ℃孵育过夜。第2天洗去未结合一抗，加入二抗室温孵育1 h，洗去未结合二抗，滴加ECL显色液于暗室曝光显影。

2 结 果

2.1SACC-LM细胞存活率 培养72 h后，细胞存活率随姜黄素浓度的增高而降低，见图1；10 μmol/L姜黄素处理时细胞增殖抑制比较合适，细胞形态完整，见图2；0 μmol/L和10 μmol/L姜黄素处理细胞24 h、48 h、72 h、96 h的吸光度OD值逐渐增高，但10 μmol/L姜黄素处理各时间点吸光度OD值均更低(P均<0.05)，见图3。

图1 不同浓度姜黄素处理72 h后SACC-LM细胞增殖情况

图2 不同浓度姜黄素处理72 h后SACC-LM细胞形态(×200)

图3 0 μmol/L和10 μmol/L姜黄素处理不同时间SACC-LM细胞增殖情况

2.2SACC-LM细胞侵袭能力 姜黄素0 μmol/L组、姜黄素1 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组细胞侵袭率分别为(112.33±3.51)%、(93.00±4.36)%、(46.00±2.08)%、(21.66±3.05)%，姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组均明显低于姜黄素0 μmol/L组和姜黄素1 μmol/L组(P均<0.05)，且姜黄素10 μmol/L组明显低于姜黄素5 μmol/L组(P<0.05)。镜下观察各组细胞侵袭情况见图4。

图4 姜黄素各组SACC-LM细胞侵袭结晶紫染色情况(×200)

2.3SACC-LM细胞迁移转移能力 姜黄素0 μmol/L组、姜黄素1 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组细胞迁移率分别为(148.66±3.51)%、(138.66±3.05)%、(80.33±4.73)%、(30.66±5.51)%，姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组均明显低于姜黄素0 μmol/L组和姜黄素1 μmol/L组(P均<0.05)，且姜黄素10 μmol/L组明显低于姜黄素5 μmol/L组(P<0.05)。镜下观察各组细胞迁移情况见图5。

2.4SACC-LM细胞凋亡情况 姜黄素0 μmol/L组、姜黄素1 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组细胞凋亡率分别为(4.46±0.47)%、(6.41±0.43)%、(8.95±0.33)%、(15.07±0.50)%，姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组均明显高于姜黄素0 μmol/L组和姜黄素1 μmol/L组(P均<0.05)，且姜黄素10 μmol/L组明显高于姜黄素5 μmol/L组(P<0.05)。各组细胞凋亡流式细胞图见图6。

2.5SACC-LM细胞中JAK-STAT3信号通路相关蛋白表达情况 姜黄素10 μmol/L组SACC-LM细胞中STAT3、TIMP1、SNAIL、CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表达量均明显低于姜黄素0μmol/L组(P均<0.05)。见图7。

图5 姜黄素各组SACC-LM细胞迁移情况(×200)

图6 姜黄素各组SACC-LM细胞凋亡流式细胞图

3 讨 论

姜黄素的抗癌作用主要与其抗增殖和促凋亡作用有关，这已在人结肠癌细胞、人乳头状甲状腺癌细胞、慢性粒细胞白血病细胞系等体外研究中被证实[4-6]。体内研究也表明姜黄素可以阻止癌细胞扩散并抑制血管生成[7-8]。Bielak-Zmijewska等[9]观察到姜黄素诱导结肠癌细胞(HCT116系)和正常成纤维细胞凋亡的浓度分别为10 μmol/L和40 μmol/L。本研究用不同浓度的姜黄素处理SACC-LM细胞72 h，发现姜黄素可呈浓度依赖性抑制SACC-LM细胞的增殖，即随着姜黄素浓度的增高，抑制效果增强；且姜黄素浓度为10 μmol/L时，细胞的增殖受到了明显抑制，但是细胞的形态保持完好，当姜黄素浓度为15 μmol/L时，SACC-LM细胞出现了断层似的死亡。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示姜黄素能呈浓度依赖性明显抑制SACC-LM细胞的侵袭和迁移，细胞凋亡检测显示姜黄素能呈浓度依赖性促进SACC-LM细胞凋亡。以上实验证实姜黄素能明显抑制SACC-LM细胞的增殖、侵袭和转移，促进SACC-LM细胞凋亡。

图7 2组SACC-LM细胞中JAK-STAT3信号通路相关蛋白表达情况

JAK-STAT信号通路是由酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK、信号转导和转录活化因子(STATs)组成的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡、转移等生物学过程[10-11]。STATs主要存在于胞浆中，其激活后可以转入细胞核内与DNA结合，可以转导细胞内的信号，调控转录过程。其中STAT3与肿瘤的关系最为密切，活化的STAT3蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与目的基因启动子区域结合，调控特定靶基因如CyclinD1、c-myc、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9、vemintin、VEGF等转录，这些转录产物分别在细胞增殖、细胞侵袭转移和血管生成中发挥关键作用[12]。目前已经发现JAK-STAT3信号通路在肝癌[13]、肺癌[14]、直肠癌[15]、乳腺癌[16]、胃癌[17]等多种恶性肿瘤中存在过度激活。Wang等[18]报道，JAK-STAT信号通路异常与腺样囊性癌的发生发展有密切联系，以JAK-STAT信号通路为靶点进行干预有望成为腺样囊性癌治疗的新途径。相关研究证实，姜黄素能够通过调控JAK-STAT信号传导通路，抑制宫颈癌Hela细胞、胃癌SGC-7901细胞和肝癌Hep3细胞增殖[19-20]。在视网膜母细胞瘤中，给予姜黄素可增加miR-99a的表达，减少JAK1、STAT1和STAT3的表达，进而诱导凋亡细胞死亡并抑制细胞增殖、迁移[21]。Rajitha等[22]报道，姜黄素可通过抑制NF-κB途径，下调STAT3，从而预防血管新生来抑制肿瘤细胞增殖。本实验结果显示，10 μmol/L姜黄素处理SACC-LM细胞后，STAT3、TIMP1、SNAIL、CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表达均明显下调，其中TIMP1、SNAIL、MMP-9、MMP-2是STAT3下游与细胞增殖、抗凋亡和转移相关的靶基因，受JAK-STAT3信号通路调控，故提示姜黄素可能通过调控JAK-STAT3信号通路来发挥抑制SACC-LM细胞增殖、侵袭和转移的作用。

综上所述，姜黄素可抑制SACC-LM细胞增殖、侵袭和转移，促进SACC-LM细胞凋亡，其作用机制可能与调控JAK-STAT3信号通路有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。