地黄饮子治疗血管性痴呆的网络药理学分子机制研究

刘影哲,吕 蓉,杨建飞,王晓源,夏兆晨,潘祥宾

(1. 黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2. 黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;3. 黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)指的是由于脑血管因素(出血性、缺血性、急慢性缺氧性脑血管病等)造成脑组织的损害进而使得认知功能减退的临床综合征[1]，它是继阿尔茨海默病之后最常见的引起痴呆症的原因之一。预估到2030年，全世界患痴呆的人数将达到8 200万，到2050年将增至1.52亿[2]，调查结果显示VD的患病率在60岁以上的人群中达到1.26%～2.40%,占所有痴呆病因的12%～20%[3]。VD的发病机制主要包括胆碱能系统受损、兴奋性氨基酸学说、自由基学说、突触可塑性、炎性反应、遗传机制等[4]。根据其发病机制，目前临床治疗VD主要采用胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂，可使患者的认知功能得到轻度改善，但其日常生活能力并未有明显改善[5]。因此如何通过早期预防及治疗来改善患者的认知功能对于患者本人及社会都有非常重要的意义。中医学认为VD的病因主要是本虚标实，本虚是气血阴精亏虚，标实是气火痰瘀内阻[6]。地黄饮子是出自《黄帝素问宣明论方》中的经典方，临床研究及实验研究皆证实该方治疗VD多有良效[7]。本研究采用网络药理学的方法探讨了地黄饮子治疗VD的作用机制，以为后期的实验研究开拓思路，为临床应用提供科学的依据。

1 方 法

1.1地黄饮子加减活性成分的筛选及靶点 利用TCMSP[8]、化学专业数据库[9]、ETCM数据库[10]及文献[11-30]查找地黄饮子的化学成分，包括肉苁蓉、熟地黄、山茱萸、麦冬、巴戟天、附子、石斛、五味子、茯苓、肉桂、远志、石菖蒲、生姜、大枣、薄荷15味中药。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18[31]为筛选活性成分的条件，再利用TCMSP自带的靶点预测模型对筛选出来的活性成分进行靶点预测，最后通过UniProt数据库[32]将得到的靶蛋白转化成相对应的基因简称。

1.2VD疾病靶点检索 以“Vascular Dementia”为关键词，在GeneCards[33]、DrugBank[34]、OMIM[35]疾病基因数据库进行检索与筛选，将得到的结果合并后去重，保留获得的唯一有关VD疾病的靶点，并与1.1中得到的作用靶点取交集，获得地黄饮子治疗VD的潜在作用靶点。

1.3构建“地黄饮子-活性成分-靶点”网络 将中药、活性成分和关键靶点信息整理成Excel表上传至Cytoscape 3.7.1[36]来构建“地黄饮子-活性成分-靶点”网络，用node来表示成分或靶点，用edge来表示它们之间的联系；用 NetworkAnalyzer 分析工具进行分析，得到degree、betweenness以及closenesss等数值，以此来探讨成分与靶点之间的联系。

1.4关键作用靶点的筛选及蛋白相互作用(PPI)网络的构建 将地黄饮子治疗VD的关键作用靶点导入STRING[37]数据库，选择的物种为人类，其余均为默认设置，剔除掉孤立的靶点，进而得到核心靶点。将得到的结果保存为TSV 格式文件，将其导入到 Cytoscape 3.7.1 软件，构画出PPI 网络图。其中，node代表治疗VD的作用靶点，edge代表靶点与靶点之间有相互作用。

1.5GO 富集分析和 KEGG 通路富集分析 采用Metascape[38]数据库对1.4中的靶点进行GO和KEGG通路富集分析，并保存结果对其进行可视化分析，以此探索相关的生物学通路，进而解释出地黄饮子治疗VD的作用机制。

1.6“地黄饮子-活性成分-靶点-KEGG通路”网络的构建 按照P值从小到大的顺序，选取1.5中得到的可能与VD相关的前20条KEGG信号通路，将其与药物、活性成分及潜在作用靶点一起整理成Excel表，并上传至Cytoscape 3.7.1软件，构建出“地黄饮子-活性成分-靶点-KEGG通路”网络。

2 结 果

2.1地黄饮子活性成分及靶点获取 从 TCMSP数据库初步获取地黄饮子成分，通过OB值 和DL值的筛选后，共获得81个活性成分(见图1)，将靶点预测结果合并后排除重复值，共获得262个靶点。

图1 地黄饮子活性成分

2.2VD疾病相关靶点获取 通过 GeneCards 、Drugbank、OMIM数据库分别获得有关VD疾病靶点为4 159个、9个、118个，合并筛选并去重后共得到1 140个与VD相关的靶点。将地黄饮子作用靶点与VD靶点共同导入到Venny 2.1.0[39]在线工具绘制韦恩图，最后获得的交集靶点有118个。见图2。

2.3“地黄饮子-活性成分-靶点”网络构建和分析 运用 Cytoscape 3.7.1对地黄饮子的活性成分及其作用靶点进行分析，共得到358个节点与1 726条关系(见图3)，并绘制出网络图。Degree较高的化合物有槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、柚皮素(naringenin)等。

图2 地黄饮子靶点和VD靶点分布图

六边形为药物活性成分，菱形为靶点，面积代表degree值大小；A1为巴戟天、山茱萸所共有；A2为巴戟天、薄荷所共有；B1为麦冬、石斛、山茱萸、大枣、肉苁蓉、生姜、巴戟天所共有；C1为附子、山茱萸、熟地黄、薄荷、石斛、巴戟天所共有；D1为肉苁蓉、石斛、巴戟天、山茱萸、大枣、生姜所共有；E1为生姜、远志、巴戟天、石斛、肉桂、石菖蒲所共有；F1为石斛、薄荷、巴戟天、山茱萸所共有；G1为薄荷、生姜所共有；G2为石斛、薄荷所共有；H1为熟地黄、生姜、麦冬、大枣、山茱萸、石菖蒲所共有；I1为熟地黄、山茱萸所共有；J1为石斛、远志所共有

2.4地黄饮子治疗VD的PPI网络构建 将地黄饮子治疗VD的118个作用靶点导入到STRING 数据库，进行蛋白间作用分析后，将得到的结果保存为TSV文件，并将其导入Cytocape 3.7.1软件绘制 PPI 网络(见图4)。隐藏游离靶点，最后图中共有117个节点，2 290条边，节点平均Degree为39,PPI的富集显著性P<1.0e-16。以平均Degree值的2倍进行核心靶点的筛选，得到8个核心调控基因靶点，分别为AKT1、IL-6、MAPK3、TNF、VEGFA、TP53、CASP3、JUN。

图4 地黄饮子治疗VD的PPI网络图

2.5地黄饮子治疗VD通路富集分析可视化 利用 Metascape 平台对关键靶点进行富集分析，包括了 GO 的 BP(biological process)、CC(cellular component)、MF(molecular function)以及KEGG通路，保存数据结果，按照P值由小到大的顺序选取排名前20的结果，将其导入微生信[40]在线作图工具，对其进行可视化分析(见图5及图6)。GO富集分析中主要包括对脂多糖的反应、细胞成分运动的正向调节、活性氧代谢过程、血管形态发生、对抗生素的反应、血管发育、氧化应激反应、心血管系统发育、对氧气水平的反应等生物过程(BP)；细胞因子受体结合、细胞因子活性、激酶结合、铵离子结合、蛋白激酶活性、核糖核酸聚合酶Ⅱ转录因子结合、磷酸酶结合、磷酸转移酶活性、氧化还原酶活性、蛋白质结构域特异性结合等分子功能(MF)；树(状)突、囊泡腔、细胞质小泡腔、薄膜侧面、细胞外基质、神经元细胞体、质膜外侧、突触后膜等细胞组成(CC)。KEGG富集分析主要包括P13K-Akt信号通路、MAPK信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路等。

图5 地黄饮子治疗VD作用靶点的KEGG富集分析

图6 地黄饮子治疗VD作用靶点GO富集分析

2.6“地黄饮子-活性成分-靶点-KEGG 通路”网络 将从“2.5”中得到的前20条KEGG信号通路，与药物、活性成分及潜在作用靶点共同导入Cytoscape 3.7.1软件，得到“地黄饮子-活性成分-靶点-KEGG 通路”的多维网络图(见图7)。并对其进行网络分析，结果显示共有278个节点和2 267条边，节点平均Degree为7，其中槲皮素(quercetin)的Degree值为646，靶点蛋白AKT1、RELA、SCP1、CASP3、MAPK1、JUN、TNF、MAPK8、BAX、CASP9、TP53、IL-6、CHUK、PTGS2、MAPK3、CASP8、CCND1、RAF1、STAT1、PPARG、NOS3、MAPK14、IL1B、VEGFA、FOS、MAPK10、PRKCA、MYC、EGFR、IFNG、NCOA2、TGFB1、GSK3B、ICAM1、CXCL8、SCN5A、PGR、PTGS1、CHRM1、MMP9的Degree值在平均Degree值的2倍以上，提示上述的靶点蛋白均在网络中具有重要的作用。

图7 地黄饮子-活性成分-靶点-KEGG通路网络

3 讨 论

在中医学中VD可归属于“愚痴”“痴证”“呆病”之内，《景岳全书·杂证谟·癫狂痴呆》记载“痴呆证，凡素无痰，而或以郁结，或以不遂，或以思虑，或以疑惑，或以惊恐而渐至痴呆”，这是首次提出的有关痴呆病名的记载。《灵枢·经脉》云：“人始生，先成精，精成而脑髓生。”只有在保证肾精充足的情况下，五脏才得以和调，脑髓才得养，人才能够拥有正常的思维，所以临床上常用具有补肾化痰开窍作用的地黄饮子来治疗本病。

3.1药物活性成分分析 本次网络药理学研究发现地黄饮子的多味药物中皆有6种活性成分，而且有一些活性成分已经被证实对于VD的治疗具有重要的意义。例如，槲皮素存在于肉苁蓉、石斛、巴戟天、山茱萸、大枣、生姜中，其可能是通过减少氧化损伤、灭活RAGE介导的通路和维持胆碱能神经元功能来提供神经血管保护[41]；山柰酚存在于生姜、远志、巴戟天、石斛、肉桂、石菖蒲中，其通过增高脑组织中SOD活性、海马和皮质中抗氧化蛋白DJ-1的表达水平[42]来改善模型大鼠的认知功能障碍,还可能参与了神经炎症系统[43]；木犀草素存在于石斛、薄荷、巴戟天、山茱萸中，其通过抑制核因子κB信号传导发挥显著的抗炎和抗氧化作用，进而发挥神经保护作用[44]；豆甾醇存在于熟地黄、生姜、麦冬、大枣、山茱萸、石菖蒲中，其通过减轻炎症及通过NF-κB p65途径改善大鼠抗氧化防御来减轻脑损伤，还可以通过减少促凋亡基因(Bax)、Caspase-3及增加抗凋亡基因(Bcl-XL)的表达来减少神经元的凋亡[45]；柚皮素存在于薄荷、生姜中，其通过调节NF-κB信号通路和激活PI3K/Akt通路有效地减少神经元凋亡和减轻神经炎症[46]。

3.2关键靶点分析 本研究经筛选后共得出117个潜在关键靶点。根据Dgree值的2倍进行核心靶点的筛选，得到8个核心靶点，分别为CASP3、TNF、IL-6、VEGFA、AKT1、MAPK3、TP53、JUN。目前研究多集中在CASP3、TNF-α、IL-6、VEGFA等靶点。长期慢性脑缺血可导致脑细胞凋亡,其中CASP3是细胞凋亡的关键因子和凋亡信号传递的共同通路[47]，在本病的发生发展中具有重要调控作用；VD的发生与免疫和炎症机制相关，TNF-α、IL-6等参与炎症反应的发生，引起海马区组织产生了病理性损害[48]，在VD治疗时辅助抗感染治疗具有重要意义[49]；VEGFA是血管生成、血管通透性、内皮细胞生长、促进细胞迁移和抑制细胞凋亡的主要调节剂，在VD发生时VEGFA表达上调[50]。其他靶点如AKT1、MAPK3、TP53、JUN等与其活性成分的相关性较高，但目前的研究并没有被提及，可为此提供新的研究方向。

3.3通路及生物进程分析 本研究共获得KEGG通路352条，富集结果显示地黄饮子治疗VD主要涉及PI3K/Akt 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等。

PI3K/Akt信号通路主要由AKT1、CASP9、EGF、EGFR、IL-2、IL-4、IL-6、INSR、KDR、MAPK1、MAPK3、TP53、VEGFA等靶点构成。该通路存在于各种神经细胞中，其通过下游的eNOS/NO途径来调节血管舒缩功能进而维持脑血流量；通过影响葡萄糖代谢来保护神经元；通过促进 Caspase-9 等蛋白的磷酸化来促进神经干细胞存活；Akt的Ser473位点磷酸化后还可调节突触可塑性[51]。因此地黄饮子可能是通过调控PI3K/Akt 信号通路中的上述相关靶点蛋白来预防VD发生。

肿瘤坏死因子信号通路主要由MAPK14、AKT1、CASP3、CASP7、CASP8、IL-1B、IL-6、JUN、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK10、CCL2、TNF等靶点构成。TNF-α能够直接刺激急性期反应，并通过其已知的下游病理级联间接介导慢性炎症反应而加重脑组织缺血及再灌注[52]。此外，肿瘤坏死因子的升高可以促进其他促炎细胞因子如一氧化氮(NO)、IL-1β、IL-6或活性氧(ROS)的产生，从而诱导脱髓鞘、神经元变性和兴奋毒性。Xu等[53]提出靶向TNF-α是治疗神经炎性疾病的一种有前途的方法。

MAPK信号通路主要由AKT1、CASP3、MAPK14、EGF、EGFR、IL-1A、IL-1B、IL-6、JUN、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK10、TNF、TP53、VEGFA等靶点构成。MAPK信号通路参与介导脑缺血损伤中神经细胞的周期控制、细胞的凋亡和细胞凋亡的分化。p38MAPK通路的激活参与介导炎症及应激反应中的细胞凋亡[54]，Yang等[55]已经确定p38 MAPK抑制剂是潜在的治疗方法。

IL-17信号通路主要由CASP3、CASP8、MAPK14、IL-1B、IL-4、IL-6、JUN、MMP1、MMP3、MMP9、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK10、CCL2、TNF等靶点构成。IL-17属于CD4+效应性T细胞，可直接诱导炎性细胞的浸润，而免疫反应和炎性反应参与脑缺血后引起的继发性损伤[56]。

综上所述，地黄饮子通过多成分、多靶点、多通路的途径来治疗VD，为临床地黄饮子治疗VD提供了新的思路，也为进一步研究提供了新的方向。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。