背部皮下注射过表达ZFP580基因转染的EPCs介导裸鼠局部血管生成情况观察

黄佳雯，张梅，韦淑萍

1 西安市中医医院心血管病科，西安710021；2 武警特色中心心内科；3 武警后勤学院卫勤系人体形态学教研室

急性心肌梗死（AMI）是指冠状动脉急性、持续性缺血缺氧引起心肌坏死的急危病症，是目前全球范围内的主要死亡原因之一［1］。目前可通过药物及血运重建等治疗有效挽救患者生命，但损伤心肌功能的恢复仍存在局限性。内皮祖细胞（EPCs）是一类尚未表达成熟内皮细胞（ECs）表型的干细胞，具有促进血管生成和修复内皮的功能［2］。研究表明，EPCs可通过促进血管生成和血栓再通，减少心肌坏死面积，改善左室功能［3］。因此，提高EPCs 的血管生成能力对于改善AMI 患者预后十分重要。ZFP580 基因是由本课题组克隆得到的一种新型C2H2锌指基因［4］。前期研究［5］发现，随着EPCs分化为成熟ECs，ZFP580 基因表达随之增强。过表达ZFP580 基因后可促进EPCs 向成熟ECs 分化。利用siRNA 腺病毒载体干扰EPCs 中ZFP580 基因表达后，EPCs 体外血管生成能力降低，提示ZFP580 基因参与EPCs 介导的体外血管生成［6］。基于以上研究，本研究观察了背部皮下注射过表达ZFP580 基因转染的EPCs 介导的裸鼠局部血管生成情况，为提高EPCs 血管生成能力及改善AMI 患者预后提供新的策略和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本课题研究所需动物均从中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心采购，选用月龄2 个月、体质量约150 g 左右的雄性SD 大鼠，用于提取骨髓源性EPCs。选用周龄6周，体质量约30 g左右的雄性BALB/c 裸鼠，进行体内血管生成实验。动物许可证号：SCXK-（军）2012-0004。

1.2 主要试剂 大鼠内皮祖细胞分离液采购于中国医学科学院生物医学工程研究院；VEGF、FGF 购自美国Peprotech 公司；反转录试剂盒购自北京TaKaRa 公司；β-actin 抗体、ZFP580 抗体、vWF 抗体采购于美国Abcam 公司；Matrigel 胶购自于美国Trevigen 公司；其他实验所需生化试剂均为进口分装或国产分析纯；ZFP580及β-actin引物序列均由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 大鼠骨髓源性EPCs 提取、培养、分组及ZFP580 基因转染 将颈椎脱臼法处死的SD 大鼠放入75%乙醇中浸泡15 min，无菌条件下剪取大鼠股骨和胫骨，剥离肌肉后暴露股骨、胫骨两端，用2 mL注射器抽取0.01 mol/L 的PBS 液冲洗骨髓。采用Ficoll 密度梯度离心20 min（1 800 r/min）分离骨髓单个核细胞，得到纯度较高的EPCs，调整细胞密度，以4×106/mL 接种于包被纤维粘连蛋白的细胞培养瓶［7］。用含有20%FBS、10 ng/mL VEGF、10 ng/mL FGF、1%双抗（青霉素、链霉素）及高糖DMEM 培养基，37 ℃、5%CO2孵育箱中培养。以腺病毒为载体，构建过表达ZFP580 基因（Ad-ZFP580）和低表达ZFP580 基因（Ad-siZFP580），分别以过表达病毒空载（Ad-NC）、低表达病毒空载（Ad-si-scrambled）作为对照。将培养至第3 d 的EPCs 以2×105密度将处于接种于6 孔培养板中，待长到第7 d 细胞融合至60%时，将Ad-ZFP580（MOI=10）、Ad-siZFP580（MOI=50）分别转染EPCs（Ad-ZFP580 组、Ad-siZFP580 组），分别 以Ad-NC、Ad-si-scrambled 转 染EPCs 作 为 对 照（Ad-NC 组、Ad-si-scrambled 组），转染48 h 后通过观察绿色荧光表达评估转染效率。待达到80%左右的转染效率时，用于以下实验。采用qRT-PCR 检测各组病毒转染细胞后ZFP580 mRNA，Western blotting 法检测ZFP580 蛋白。Ad-NC 组、Ad-ZFP580 组、Ad-si-scrambled 组、Ad-siZFP580 组ZFP580 mRNA相 对 表 达 量 分 别 为1.03 ± 0.04、1.71 ± 0.10、1.03 ± 0.05、0.41 ± 0.06，ZFP580 蛋白相对表达量分 别 为0.99 ± 0.04、2.14 ± 0.20、1.01 ± 0.02、0.54 ± 0.09，Ad-ZFP580 组的ZFP580 mRNA、蛋白相 对 表 达 水 平 明 显 高 于Ad-NC（P＜0.05），Ad-siZFP580 组的ZFP580 mRNA、蛋白相对表达水平明显低于Ad-si-scrambled（P＜0.05），以上结果提示从基因和蛋白水平上证明了腺病毒成功转染EPCs，有效增强或降低了其内源性ZFP580的表达。

1.4 过表达ZFP580 基因转染的EPCs 细胞悬液与Matrigel 胶混合及混合物在裸鼠背部皮下注射方法和皮下胶体取材 将Matrigel 胶液先放置于盛有冰块的烧杯中，4 ℃冰箱过夜，冻融后用于实验。选6周龄裸鼠24 只，将其随机分为4 组，每组6 只，在裸鼠尾部标记序号用以分组区别。将Ad-NC 组、Ad-ZFP580组、Ad-si-scrambled 组、Ad-siZFP580组贴壁的EPCs以0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液离心后得到细胞沉淀，经细胞计数后取5×105个EPCs 与100 μL Matrigel 胶液混合均匀。同时将水合氯醛按照100 mg/kg 配比腹腔注射麻醉裸鼠，用注射器抽取1 mL 各组细胞悬液与Matrigel 胶的混合物，注射至裸鼠的背部皮下。7 d后颈椎脱臼处死裸鼠，取其背部皮下的胶体做好标记，置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后切片。

1.5 裸鼠背部皮下胶体血管管腔生成数目检测 采用HE 染色法。取各组石蜡包埋后切片。首先应用二甲苯对体外血管生成实验收集的各组标本切片进行脱蜡3 次，每次10 min；按照无水乙醇、95%、90%、80%、70%的酒精梯度进行脱苯各5 min，自来水冲洗；切片滴加苏木素染液浸染10 min，自来水冲洗1 min；置于1%盐酸酒精1 min 使其分化，自来水再次冲洗；采用1%伊红染色1 min；进行酒精梯度上行脱水，二甲苯透明后，应用中性树胶封片。100倍显微镜下观察血管管腔生成数目，多个ECs与基膜围成的结构即为血管管腔结构。

1.6 裸鼠背部皮下胶体vWF 阳性结构数目检测 采用免疫组化vWF 染色法。收集各组石蜡标本切片，做好标记，第一步用二甲苯对石蜡标本切片脱蜡，然后按照酒精梯度进行水化；3%过氧化氢室温孵育5～10 min，使内源性过氧化物酶失活；PBS冲洗5 min；第二步采用微波抗原修复，标本切片放置于温度在92～98 ℃的微波炉内20 min；第三步血清封闭，10%山羊血清室温封闭切片标本10 min；第四步抗体孵育，丢弃血清后，切记请勿用水清洗切片，按照比例滴加vWF 抗体，放置37℃孵育2 h；PBS冲洗3 次，每次5 min，按1∶500 滴加二抗，37 ℃孵育30 min，再次用PBS 冲洗；第五步DAB 显色10 min，注意需用显微镜观察显色情况。水冲洗后滴加苏木素染液再次浸染，酒精浓度梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。100 倍显微镜下观察血管管腔vWF阳性结构数目，vWF 染色定位于血管管腔ECs 细胞质，棕褐色染色即为vWF阳性。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胶体中血管管腔生成数目比较 Ad-ZFP580 组、Ad-NC 组胶体中血管管腔生成数目分别为（4.83 ± 0.75）、（2.00 ± 0.63）个，Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled 组胶体中血管管腔生成数目分别为（0.50 ± 0.55）、（2.17 ± 0.41）个，Ad-ZFP580组、Ad-NC 组比较，Ad-siZFP580 组、Ad-si-scrambled组比较，P均＜0.05。

2.2 各组胶体中血管管腔的vWF 阳性结构数目比较 Ad-ZFP580 组、Ad-NC 组胶体中胶体中血管管腔的vWF 阳性结构数目分别为（4.67 ± 0.82）、（1.83 ± 0.41）个，Ad-siZFP580 组、Ad-si-scrambled组胶体中胶体中血管管腔的vWF 阳性结构数目分别为（0.67 ± 0.52）、（1.83 ± 0.75）个，Ad-ZFP580组、Ad-NC 组比较，Ad-siZFP580 组、Ad-si-scrambled组比较，P均＜0.05。

3 讨论

随着社会经济发展、人口老龄化严重及生活水平提高，AMI发病率逐年递增。据数据统计，我国约有2.9亿人患有心血管疾病，其中约超过250万人患有AMI［8］，而且AMI 发病年龄逐渐年轻化。内科药物溶栓、冠脉介术入、外科血管搭桥等治疗手段可有效恢复部分心肌梗死区域的血供，拯救患者生命，一定程度改善AMI患者生活质量及预后［9］。但是仍有许多患者未能及时开通病变血管，进行血运重建，导致心肌细胞出现不可逆性损伤和坏死，引起心室重塑和心功能不全。因此，需寻求新的治疗方法保护缺血的心肌，延缓甚至可逆转AMI 后心室重塑，预防患者心功能不全的发生。有研究发现，刺激缺血区域血管生成，提高心肌细胞存活率，可减少对心脏收缩功能的影响［10］。EPCs 是一类能动员、循环、增殖并分化为血管ECs，但尚未表达成熟血管ECs 表型，也未形成血管的前体细胞［2］，其参与了缺血组织的血管生成，能够减少缺血面积，增加缺血心肌的血供，改善左心室功能［3，11］。EPCs 最早在1997 年由ASAHARA 等［12］首次发现并提出，该团队从成人外周血中分离出来EPCs，且能分化成为血管ECs。其后EPCs被研究者在体外诱导培养，发现其具有形成管腔样结构的能力，不仅参与胚胎时期血管新生，同时也在成人血管生成中发挥关键作用［13］。近年研究显示，EPCs 在缺血性疾病如AMI、外周血管疾病等研究治疗方面有十分广阔的应用前景［14-15］，但目前仍处于起步阶段，存在很多问题需要深入研究，如EPCs 如何优化培养、基因调控分化机制、如何提高EPCs 血管生成能力、下一步临床应用研究等。因此，EPCs 的生物学效应调节机制、其血管生成能力提高及潜在治疗作用是目前热点研究项目。

本课题组前期通过人主动脉cDNA 文库筛选得到cDNA 全长为1726 bp 的人ZNF580 基因（Genbank注册号：AF184939），随后克隆了与ZNF580 基因功能一致的大鼠同源ZFP580 cDNA 序列，两者氨基酸序列相似度达97%［16］。ZFP580 基因作为新型的锌指家族基因，它的蛋白结构与家族成员中转录因子krüppel-like-factor（KLF）相似［4］。KLF 家族成员具有调节细胞增殖、分化、生长和凋亡的作用［17］。作为KLF 家族中重要的转录因子，KLF2 和KLF4 可通过参与多条分子信号通路促进EPCs 向成熟ECs 的分化过程［18-19］。作为与KLF 蛋白结构高度相似的ZFP580基因，前期实验研究已经证实其可促进血管ECs 增殖、迁移等，参与血管再内皮化过程［20］。但是，ZFP580基因在血管生成方面的生物学特点及具体调控机制并不十分清楚。因此本课题组主要研究ZFP580 基因对EPCs 分化作用的影响，在此基础上探讨对其血管生成能力的影响及相关调控信号网络。前期工作中已观察到在EPCs 向成熟ECs 分化的过程，ZFP580基因表达逐渐增强。随后我们应用腺病毒转染技术，过表达ZFP580 基因后，可加快EPCs 其向成熟ECs 表型的分化［5］，可能通过激活eNOS/NO 途径参与调控EPCs 分化过程［21］。进一步研究ZFP580基因在血管生成方面的生物学作用，当干扰EPCs 内源性的ZFP580 基因表达后，EPCs 体外血管生成能力降低，这也揭示了ZFP580 基因参与EPCs 介导的体外血管生成［6］。在此前期研究基础上，我们设计此实验研究，目的在于验证过表达ZFP580 基因对EPCs 介导的动物体内血管生成能力的影响，更进一步探讨ZFP580 基因对EPCs 血管生成的生物学效应。以期ZFP580 有望成为促进血管生成、修复内皮功能的关键候选基因，同时为提高EPCs 血管生成能力提供新的思路。本研究显示，Ad-ZFP580组生成血管管腔数目及管腔vWF阳性结构数目比Ad-NC组明显增多，Ad-siZFP580组生成血管管腔数目及管腔vWF 阳性结构数目比Ad-siscrambled 组明显减少，说明过表达ZFP580 基因可增强EPCs介导的裸鼠体内血管生成能力。

总之，过表达ZFP580 基因后可增加EPCs 介导的裸鼠体内血管管腔生成能力，而低表达ZFP580基因后则抑制EPCs 介导的裸鼠体内血管生成，说明ZFP580 基因参与EPCs 介导的体内血管生成过程。但ZFP580基因介导EPCs 的血管生成作用能否进一步应用于AMI 等疾病的治疗领域，尚未进行相关动物实验研究。以及其详细的调控机制网络也未完全阐明，仍需我们进行更多深入、广泛的研究，从分子水平、体内外水平、临床应用价值等全面深入认识ZFP580基因的生物学功能。