粪便miRNA作为结直肠癌生物标记物的价值

曾家兴 田菁菁 卢伟 黄锐 陈俊豪张林 谢雪晴 张媛玲 丁杰

1贵州省人民医院普外科（贵阳 550000）；2贵州医科大学（贵阳 550000）；3贵州大学医学院（贵阳 550000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在临床上占消化系统恶性肿瘤之首，据2020年GLOBOCAN 统计报告表明，CRC 是全球第三大常见癌症，也是癌症死亡的第二大原因［1］。虽然90%的早期诊断患者总存活率超过5年，但在远处转移的患者中，这一数字不到10%［2］。然而，CRC 通常在早期阶段没有症状，并在人群中零星出现，对有效和及时的治疗构成了挑战。因此，利用一种非侵入性方法对无症状个体进行大规模筛查是一项公共卫生高度的优先事项。

1 结直肠癌的筛查方式

目前筛查CRC 的常见方法有粪便隐血试验（fecal occult blood test，FOBT）、粪便免疫化学检测（fecal immunochemical test，FIT）以及肠镜等。FOBT是最广泛的CRC 筛查方法，成本低廉且无创，但易被饮食等其他因素干扰，易出现假阳性。FIT 和FOBT 类似，是利用针对人类珠蛋白抗体检测粪便中的血红蛋白，不受进食影响，与FOBT 相比，CRC筛查的参与度和CRC 的诊断率更高［3］，但抗体在转运和储存过程中易降解，且由于间歇性出血以及粪便中血红蛋白的降解，导致约一半的CRC 和大多数息肉没有被发现。肠镜检查是诊断CRC 最直接准确的方法，且病理结果是诊断CRC 和评估TNM 分期的金标准，由于需要肠道准备、饮食限制且存在侵入性、成本高和严重并发症（如肠出血和肠穿孔等），导致患者的依从性低且难以作为CRC的常规筛查。另外如CT、MRI、钡剂灌肠、腔内超声、肿瘤标记物（CEA、CA199）和粪便DNA 等检查，同样具有侵入性、费用昂贵、依从性低、敏感性和特异性低等问题。因此，目前迫切需要一种成本效益高的非侵入性CRC 筛查方法来最大限度地提高检测准确率。

2 粪便miRNA 与结直肠癌的相关性

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类单链内源性非编码小分子RNA，约由22 个核苷酸组成，来源于发卡结构，广泛存在于动物、植物和一些病毒中，超过60%的蛋白编码基因由miRNA 调控，它在转录后水平负向调节基因表达［4］。成熟的miRNA 与AGO 蛋白（argonaute proteins）络合成RNA 诱导沉默复合体（RNA⁃induced silencing com⁃plex，RISC），再通过引导AGO 蛋白和相关因子到mRNA 的3′端非翻译区（untranslated region，3′UTR）的靶位点，活性miRNA 种子区与靶mRNA 的3′UTR完全碱基配对导致mRNA 断裂降解；而部分碱基配对抑制了翻译的起始或延伸阶段［5］。单个miR⁃NA 可以调控多个靶基因，几个miRNA 组合也可以精细调控某个基因的表达［4］。根据miRNA 在肿瘤中的功能和地位，一般将miRNA 分为促肿瘤miR⁃NA（oncomiR）和肿瘤抑制miRNA（tumor suppressor miRNA，tsmiR），oncomiR 抑制编码肿瘤抑制蛋白的mRNA 来促进肿瘤，通常在肿瘤中表达上调，相反，tsmiR 在肿瘤中表达降低，因此它们靶向的致瘤mRNA 过度表达，特定的miRNA 具有双重作用，可以同时产生竞争的致瘤和抑瘤效应［6］。

miRNA 的失调与CRC 的发生发展密切相关，它们通过调节细胞内的信号网络，诱导细胞增殖，产生对细胞凋亡和化疗的抵抗力，并促进转移［7］。miRNA 的异常表达可能涉及结肠癌变的各个环节，在癌组织［8］、血液［9-10］和粪便［11］中分离出这些miRNA 可认为是CRC 早期诊断和预后评估的潜在生物标志物，并且可以通过调控oncomiR 或tsmiR的功能等干预措施来抑制肿瘤。不同研究表明，在CRC 中可使用低表达的tsmiR 的模拟物进行miRNA 的替代疗法，如抑制细胞生长、迁移、侵袭和增加化疗及药物的敏感性；另一种反义治疗，在CRC 中利用干扰RNA 来阻断高表达的oncomiR 也有同样的效果［12］，这表明miRNA 靶向治疗有望成为一种新的CRC 治疗手段。

miRNA 在进化上高度保守，不容易降解，能顺利进入粪便并长期滞留，发挥调控作用，已经证明miRNA 在72 h 的孵育期内仍然可以在样品中检测到［13］。目前已在CRC 患者粪便中发现多种miRNA存在异常表达，异常的粪便miRNA 可能起源于脱落的恶性结直肠细胞，或由外泌体释放进入粪便［14］，更能直接地反映肠腔病变的生物学变化。粪便miRNA 的稳定性取决于它们的来源，因为结直肠细胞中的miRNA 和外泌体比游离miRNA 更能抵抗RNase 的降解［15］。而利用外周血液miRNA进行CRC 筛查的主要缺点是检测特异性不高［16］，因为血液中miRNA 可能来自其他肿瘤［17］、精神分裂症［18］和病毒感染［19］等。与外周血液检测相比，粪便miRNA 可以更早地检测到肿瘤细胞和大多数肿瘤标志物，具有更高的特异性、灵敏性和重复性［20］，且经济、无创。因此，粪便miRNA 可作为早期临床诊断及预后的新型CRC 生物标志物。

3 粪便来源的miRNA 检测方法及优缺点

粪便miRNA 生物标志物检测方法种类繁多，目前最主要的是RT⁃qPCR（reverse transcription quantitative⁃polymerase chain reaction，逆转录定量聚合酶链式反应）、微阵列法及RNA 测序技术等。其中RT⁃qPCR 是最常用且最广泛使用的检测技术，被认为是miRNA 检测的金标准，它可用于绝对和相对miRNA 定量，也可用于RNA 印迹法和微阵列进一步验证，但miRNA 长度短，反转录步骤的设计相对复杂，易受到引物或探针干扰等缺点。微阵列法是基于miRNA 与探针的杂交反应，它可以同时检测多个样本，并且能够检测单个样本的数百个靶序列，适用于高通量筛选和检测，但检测的范围受限于探针的信息，只能检测已知序列，而且灵敏度较差，芯片昂贵。RNA 测序技术能够鉴别miRNA 和发现未知miRNA，能够为miRNA 的发生及功能机制提供大量信息，且可以边合成边测序，耗时短，但仪器昂贵且需要专业的数据分析。

总之，粪便miRNA 不同检测方法各有优缺点，研究者需要根据miRNA 数量及信息来选择合适的检测方法，达到快速、高灵敏性特异性及高通量等目的，从而效率最大化。

4 粪便miRNA标志物在结直肠癌中的应用

4.1 粪便中单基因oncomiR 检测 oncomiR 通过靶向编码肿瘤抑制蛋白的mRNA 表现出促癌特性，这些miRNA 在CRC 患者粪便中上调。目前研究较为深入的是miR⁃21，它在CRC 中过度表达，能下调抑癌基因的表达，从而发挥促癌特性。BASTA⁃MINEJAD 等［21］采用RT⁃qPCR 检测40 例CRC 患者及40 名健康对照者的粪便，发现CRC 患者粪便的miR⁃21 表达水平较对照组显著上调10 倍，敏感性和特异性分别为86.05%、81.08%，AUC（area under the receiver operating characteristic curve，接受者操作特征曲线下面积）为0.829，能够区分CRC 患者和健康者；且指出粪便miR⁃21 表达水平差异可显著区分Ⅲ⁃Ⅳ期和Ⅰ⁃Ⅱ期（TNM 分期）CRC，其敏感性和特异性分别为88.1%和81.6%（AUC：0.872）。

LI 等［22］对77 例CRC 患者和29 例对照者的血清和粪便标本检测miRNA，结果表明在CRC 患者中血清和粪便miR⁃135b⁃5p 表达均显著上调，在区分CRC 患者及健康者上，粪便miR⁃135b⁃5p 的特异性为74.1%，敏感性为96.5%；在区别Ⅰ⁃Ⅱ期和Ⅲ⁃Ⅳ期（TNM 分期），特异性和敏感性分别为89.4%和80.9%，AUC 为0.92；而在鉴别Ⅰ⁃Ⅲ期和Ⅳ期，AUC 为0.78，且表明粪便miR⁃135b⁃5p 在区分CRC不同TNM 分期的诊断价值优于其血清水平，可作为非侵入性生物标志物用于诊断Ⅲ⁃Ⅳ期CRC患者。

另一研究在79 例健康受试者和58 例CRC 患者的137 份粪便样本进行了小RNA 测序，与健康对照相比，CRC 患者的粪便中miR⁃486⁃5p 表达明显上调，且证实了miR⁃486⁃5p 在早期患者与健康对照组，以及晚期与非转移性肿瘤的差异表达［23］，这说明了miR⁃486⁃5p 可作为CRC 诊断的特异性标志物。

4.2 粪便中单基因tsmiR 检测 除了oncomiR，一些miRNA 可作为抑癌基因被称为tsmiR，具有抑制肿瘤活性和抑制转移的特性，它们在CRC 患者粪便中经常下调。例如，AHMED 等［24］使用miRNA基因芯片对15 名个体的粪便样本进行了全局微阵列表达研究，对其中20 个选定的miRNA 进行后续的qPCR 分析研究，在60 例患者的粪便中，发现8 个miRNA 表达下调（miR⁃9、miR⁃29b、miR⁃127⁃5p、miR⁃138、miR⁃143、miR⁃146a、miR⁃222 和miR⁃938），且随着TNM 分期从早期到晚期进展，这种下调趋势更加明显。

ZHU 等［25］对80 例CRC 患者和51 例健康志愿者进行回顾性分析，检测参与者粪便样本中4 个miRNA（miR⁃29a，miR⁃145，miR⁃223 和miR⁃224）的水平，结果显示CRC 患者粪便的miR⁃29a、miR⁃223和miR⁃224 水平明显低于正常对照的粪便，且直肠癌患者粪便中的miR⁃29a 水平明显高于近端和远端结肠癌患者，而miR⁃223 和miR⁃224 与肿瘤位置无关，miR⁃29a，miR⁃223 和miR⁃224 的AUC 分别为0.777、0.649 和0.745，其敏感性和特异性分别为85%和61%、60%和71%、75%和63%。

与oncomiR 类似，CRC 患者粪便中tsmiR 表达降低，同样具有相当可观的敏感性和特异性，从而达到CRC 筛查和早期诊断的目的。

4.3 粪便中miRNA 多基因及多样本联合检测 CHOI 等［26］报道CRC 粪便中miR⁃21、miR⁃92a、miR⁃144*和miR⁃17⁃3p 的表达水平显著高于健康对照组，这4 种miRNA 检测CRC 的敏感性均在70%以上，多变量分析显示miR⁃92a和miR⁃144*与CRC显着相关，miR⁃92a的敏感性为89.7%，特异性为51.7%，AUC 为0.76，而miR⁃144*分别为78.6%、66.7%、0.77，miR⁃92a 和miR⁃144*联合检测的敏感性为96.6%，比单独运用FIT（73.8%）检测CRC 更好。

一项荟萃分析［13］对46 篇关于CRC 研究和10项关于腺瘤研究，对应CRC、腺瘤患者和健康个体的6 475、783和5 569项粪便miRNA检测，得出诊断CRC 最可靠的单个miRNA 是miR⁃21，AUC 为0.843，敏感性为59.3%，特异性为85.6%，miR⁃92a对应的值分别为0.794、46.8%、90.5%；而miR⁃21与miR⁃92a联合对应的值分别为0.837、53.7%、87.8%。另外显示晚期CRC 诊断准确率更高，远端CRC 敏感性高于近端，因此粪便miR⁃21、miR⁃92a 及其联合检测可作为基于粪便CRC 筛查有前景的无创性标志物。

大多数研究侧重于对单个样本类型（例如血清、血浆或粪便）发现新的标志物，极少有研究系统性评估同一个体不同样本类型的miRNA 在CRC 中的作用。CHANG等［27］选择46个最常报告的CRC相关的miRNA 进行检测，在检测互补效应后，联合分析粪便和血浆标本中常见的miR⁃223 和miR⁃92a，对CRC 的灵敏度最高，为96.8%，优于FOBT（70%～75%）或多靶点粪便DNA 检测（92.3%），特异性为75%，AUC 为0.907。且它们发现早期疾病或肿瘤体积较小的CRC 患者的结果与晚期疾病或肿瘤体积较大的患者相当。

因此，在两种类型的CRC 临床样本中建立miRNA 生物印记，可以用于大肠癌的早期检测，且多个miRNA 联合的互补作用显示出良好的敏感性和相当的特异性，能提高CRC 的检出率。

4.4 粪便miRNA 联合其他生物标志物检测 LI⁃ANG 等［28］收集381 例CRC 患者粪便样本，建立了一种结合miR⁃92a、miR⁃21、miR⁃135b、miR⁃145 和miR⁃133a 5 个miRNA 的评分算法（C⁃index）。通过分析CRC 全基因组miRNA 表达谱，得出在单个miRNA 中，粪便miR⁃92a 区分CRC 患者与健康者表现最好，AUC 为0.782，敏感度与特异度均为72%，而C⁃index 较单个miRNA 相比，CRC 诊断性能显著提高，AUC 为0.849，在特异性为80%时，敏感性为81%，而结合FIT 敏感性可提高到90%。对于晚期腺瘤（AA，advanced adenomas），特异性为80%时，C⁃index 的敏感性（33%）明显高于FIT（17%），结合FIT 后进一步提高到43%。

DURAN⁃SANCHON 等［29］发 现miR⁃130b⁃3p、miR⁃21⁃5p、miR⁃221⁃5p、miR⁃25⁃3p、miR⁃27a⁃3p、miR⁃34a⁃5p 和miR421 这7 个miRNA 在CRC 患者粪便中显著上调，miR⁃130b⁃3p、miR⁃21⁃5p、miR⁃27a⁃3p、miR⁃421 以及miR⁃335⁃3p 在AA 患者粪便中的表达显著上调。在作者预测模型中miR⁃421、miR⁃27a⁃3p 和血红蛋白组合识别CRC 患者的AUC 为0.93，而单独检测粪便血红蛋白浓度的AUC 为0.67。联合标记物识别AA 患者的AUC 为0.64，而单独检测粪便血红蛋白的AUC 值为0.59。总之，粪便中miRNA 和血红蛋白水平组合比单独检测粪便中的血红蛋白浓度更能准确地识别AA 或CRC患者。该作者的另一项研究［30］基于miR⁃421、miR⁃27a⁃3p 和粪便血红蛋白浓度，以及年龄和性别的一种miRFec 的算法，该算法可以将CRC 患者与非晚期腺瘤或结肠镜检查正常的患者区分开来，AUC 为90%，避免了34%的结肠镜检查。该算法有助于FIT 阳性的部分群体，基于出现CRC 的概率非常低，可以避免结肠镜检查，提高CRC 筛查的成本和效率。

总之，粪便的miRNA 对腺瘤和CRC 非侵入性检测有着较高的准确性，并且检测一组miRNA 可能会使CRC 检出率更高，而miRNA 与FOBT 或FIT的联合可能会进一步提高检测的准确性。

4.5 粪便miRNA 与结直肠癌手术的相关性 研究表明，对CRC 患者在根治性手术前后的粪便样本中的miRNA 进行检测，证实粪便miRNA 可以作为有用的动态标记物来监测治疗后的疾病研究。ROTELLI 等［31］通过RT⁃qPCR 筛查结肠镜阴性CRC 患者及健康受试者的粪便，术前5 种miRNA（miR19b⁃3p，miR20a⁃5p，miR21⁃3p，miR 92a⁃3p，和miR141）的表达水平明显高于对照组，而在根治性手术后显著降低，其中miR20a⁃5p，miR21⁃3p和miR141 水平降低到与正常对照组相当的值。

由上可见，一组特异性的粪便miRNA 在手术前过度表达，并在肿瘤切除后恢复到正常范围，有望成为一种新的可靠的大肠癌二级预防工具。然而，此类试验需要在大型前瞻性研究中加以探索，并与现有的筛查工具进行比较，评估少数粪便miRNAs 的可靠性。

4.6 粪便miRNA 与结直肠腺瘤等癌前病变的相关性 结直肠腺瘤是CRC 的主要癌前病变，尤其是晚期腺瘤，大部分CRC 都是由结直肠腺瘤演变而来。因此，通过检测某些miRNA 来区分健康者与腺瘤、CRC 患者，可以为CRC 的早期筛查及诊断提供了新的思路。

ZHAO等［32］证实粪便中miR⁃194的表达从20例健康者、20 例腺瘤患者、28 例CRC 患者逐渐降低，提示miR⁃194 表达下调可能是大肠癌发生的早期事件，且粪便miR⁃194 的表达可以区分正常人和CRC 患者其AUC 为0.739，敏感性为60%，特异性为88.1%。因此粪便miR⁃194 有可能取代组织标本成为腺瘤及CRC 患者一种重要的早期诊断标志物。另外，LIU 等［33］检测CRC、腺瘤和健康志愿者粪便标本的miR⁃21 和miR⁃146a 表达，结果表明与健康对照组比，粪便miR⁃21 水平在CRC 和腺瘤患者均显著上调，而粪便miR⁃146a 仅在CRC 患者中明显降低，腺瘤患者与健康对照组的miR⁃146a 表达差异无统计学意义，粪便miR⁃21、miR⁃146a 及其联合表达水平均能显著将CRC 患者（AUC 分别为0.877、0.794、0.878）、腺瘤患者（AUC 分别为0.877、0.794、0.878）与正常对照组区分开来；在区分CRC和腺瘤患者时，其AUC 值分别为0.699、0.815 和0.729。证实粪便标本中miRNA⁃21 和miRNA⁃146a对大肠癌的早期诊断具有潜在的应用价值。

5 展望

不少研究使用一组或多组粪便miRNA 作为生物标志物已具有较高的CRC 及癌前病变的检出率，然而，粪便miRNA 需要依赖于定量检测，并不能消除肠道微生物蛋白、DNA 和RNA 的潜在污染，而粪便miRNA 结合FIT 是提高检测准确性的可靠方法。另外一个值得考虑的问题是如果样本存在潜血，血细胞的miRNA 会干扰结果，使用FOBT/FIT 阳性和阴性样本比较的对照研究可以解决，更全面的方法是使用miRNA 分析和比较匹配的血液、粪便和肿瘤组织，它能提供miRNA 水平变化来源的信息。

总之，粪便是一种非常适合CRC 筛查的介质，粪便miRNA 对CRC 的诊断、预后和个性化治疗具有重要的临床意义，目前其检测技术发展迅速，具有广阔的应用前景，与CRC 进展相关的粪便miR⁃NA 水平定量变化，比当前临床可用的检测方法提供了更敏感更特异的非侵入性诊断标记。但仍需要大型的、理想多中心、双盲随机对照试验，来确定粪便miRNA 在普通人群中作为CRC 生物标志物的价值。