非ST段抬高型急性心肌梗死患者经皮冠状动脉介入治疗术后高残留血小板活性与血小板表面Ⅱb/Ⅲa受体、P⁃选择素及预后的关系

刘军 贾志 霍立巍

天津市北辰医院心内科（天津 300400）

非ST 段抬高型急性心肌梗死（non ST segment elevation acute myocardial infarction，NSTEMI）是临床常见的急性心肌缺血性疾病，多发于40 岁以上的中老年人群［1］。经皮冠状动脉介入治疗（percu⁃taneous coronary intervention，PCI）后双联抗血小板治疗可降低后期缺血性事件的发生风险［2-4］，但依然有10%～15%的患者在坚持应用双联抗血小板治疗后仍再发缺血性事件。高残留血小板活性（high residual platelet reactivity，HRPR）是指负荷剂量的抗血小板药物下血小板仍有较高的反应活性，目前的观点认为HRPR 是PCI 后双联抗血小板治疗再发缺血事件的重要原因［5-6］。Ⅱb/Ⅲa 受体是血小板激活后共同的最终通路，激活的受体与纤维蛋白原相互作用介导血小板的聚集，Ⅱb/Ⅲa 受体拮抗剂一直是强效的抗血小板药物［7］。P⁃选择素是血小板激活的标志物，当血小板激活时P⁃选择素的表达水平会升高［8］。GOLUKHOVA 等［9］的研究发现，PCI 术前血浆P⁃选择素水平是PCI 术后HRPR 的危险因素。本研究旨在探讨NSTEMI 患者PCI 术后HRPR 与血小板表面Ⅱb/Ⅲa 受体、P⁃选择素及预后的关系，以期探讨HRPR 影响患者预后的可能作用机制，现将研究结果整理如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用前瞻性研究的方法，于2019年1月至2019年10月收集在我院行PCI 手术治疗的NSTEMI 患者214 例，纳入标准：（1）所有患者均参考2016年中华医学会心血管病学分会制定的指南中的相关标准确诊［9］；（2）首次进行PCI 术，且支架植入成功者；（3）患者对本次研究内容均知情同意。排除标准：（1）治疗依从性欠佳，出院后未能按医嘱服药者；（2）合并重度贫血、恶性肿瘤、凝血功能障碍等严重疾病者；（3）因冠脉瘤、冠脉夹层等其他原因所致的心肌梗死；（4）既往患有心脏瓣膜病、心肌炎等心脏疾病；（5）严重肝肾功能障碍者。本实验获得本院伦理委员会的同意。

1.2 实验仪器 流式细胞仪（FACSArial，美国BD公司）、全波长酶标仪（PowerWave XS，美国BIO⁃TEK公司）、血小板聚集仪（CHRONO⁃LOG）、低温离心机（Z 400K，德国HERMLE 公司）、96 孔板（Becton Dickinson）、微量加样器（Eppendorf）。

1.3 主要溶剂及配制 主要溶剂：FITC⁃PAC⁃1（Becton Dickinson，货号：340507）、Alexa fluor 647⁃抗CD62p 抗体（Thermo Fisher，货号：A20186）、PAC⁃1（Biorbyt，货号：orb652037）、抗CD62p 抗体（Abcam，货号：BW8065）。主要配制溶液：Tyrode′s buffer：1 L液体中包含Hepes 3.575 g，NaH2PO40.59 g，NaCl 8.065 g，KCl 0.2 g，MgCl20.42 g，5%Glucose 1.09 g，BSA 2 g，pH 范围在7.35～7.45。

1.4 方法

1.4.1 制备血小板 所有受检者均于PCI术后3 d清晨在空腹状态下肘静脉采血5 mL，血液流入枸橼酸钠抗凝管后，要轻轻颠倒2 ～ 3 次，使其充分混合，不可有凝块。上述血标本以200 μg离心13 min，提取上层获得富血小板血浆。

1.4.2 检测血小板聚集率 血小板聚集仪检测血小板聚集率，在测定样品杯中加入一小磁棒和495 μL 富含血小板血浆置恒温孔中预热5 min 备用。进入Aggrolink 界面，按照说明书设置参数，打开反应仓，加入诱导剂1 mmol/L ADP 5 μL，反应时间为6 min。按“Calculate slope Amiplitute”键，按：“ok”键读取结果。

在进行血小板聚集率抑制试验时，在样品杯中预先加入5 μL PAC⁃1 或抗CP62p 抗体，再对血小板聚集率进行检测，检测步骤与上方一致。

1.4.3 流式细胞仪检测血小板Ⅱb/Ⅲa水平及P⁃选择素的水平 取45 μL Tyrode′s buffer 加入流式管中，加入5 μL 全血，加入5 μL FITC⁃PAC⁃1 和5 μL Alexa fluor 647⁃抗CD62p 抗体避光15 min 后加入200 μL Tyrode′s buffer。采用流式细胞仪检测PAC⁃1+/CD62p+、PAC⁃1-/CD62p+、PAC⁃1+/CD62p-血小板水平。

1.5 分组方法以及随访方法 根据患者的血小板聚集率进行分组，若血小板聚集率≥70%则纳入到HRPR 组，血小板聚集率＜70%则纳入到LRPR组［11］。PCI 术后根据《非ST 段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南（2016）》中的意见进行规范性治疗，术后随访1年，主要随访方式为电话随访和门诊复查，观察患者是否有缺血事件发生，缺血事件主要包括：再发心绞痛、再发心肌梗死、血栓形成。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计学软件进行数据处理与统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，计数资料用例（%）表示，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，采用Pearson 法分析相关性，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本资料 本实验共有214 例NSTEMI患者入组，并根据实验要求进行了PCI 手术及双联抗血小板方案治疗。根据术后3 d 采血检测血小板聚集率进行分组，其中HRPR 组28 例，血小板聚集率为（76.3±4.4）%，LRPR 组186 例，血小板聚集率为（41.6 ± 16.7）%。两组患者的年龄、性别、体重指数、吸烟史、高血压、糖尿病、心肌梗死、PCI病史及左心室射血分数比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 HRPR 组和LRPR 组患者基本资料比较Tab.1 Comparison of basic data of patients in HRPR group and LRPR group 例（%）

2.2 血小板PAC⁃1及CD62p水平比较 流式细胞仪检测了两组患者血小板Ⅱb/Ⅲa（PAC⁃1）及P⁃选择素（CD62p）水平。如图1 所示，HRPR 组PAC⁃1+/CD62p+、PAC⁃1-/CD62p+、PAC⁃1+/CD62p-血小板水平高于LRPR 组，差异有统计学意义（t= 10.573，9.121、11.496，均P＜0.001）。

图1 两组患者PAC⁃1+/CD62p+、PAC⁃1-/CD62p+、PAC⁃1+/CD62p-血小板水平Fig.1 PAC⁃1+/CD62p+，PAC⁃1-/CD62p+，PAC⁃1+/CD62pplatelet levels of the two groups of patients

2.3 血小板PAC⁃1 及CD62p 水平与血小板聚集率的相关性分析 经统计分析血小板Ⅱb/Ⅲa（PAC⁃1）及P⁃选择素（CD62p）水平与血小板聚集率水平的关系发现，血小板聚集率水平与PAC⁃1+/CD62p+（r= 0.302，P= 0.023）、PAC⁃1+/CD62p-（r=0.319，P= 0.012）水平呈正相关，而PAC⁃1-/CD62p+水平与血小板聚集率之间无相关性（r= 0.264，P=0.097）。

2.4 血小板聚集率抑制试验 PAC⁃1 及抗CD62p抗体预先孵育血小板后检测血小板的聚集率变化，见图2，PAC⁃1 预先孵育血小板后，HRPR 组以及LRPR 组血小板聚集率明显降低（t= 15.827，23.204，均P＜0.001）；抗CD62p 抗体预先孵育血小板后，HRPR 组以及LRPR 组血小板聚集率并无明显变化（t=1.656、1.509，P=0.103、0.132）。

图2 血小板聚集率抑制试验Fig.2 Platelet aggregation rate inhibition test

2.5 两组患者缺血不良事件 随访1年后HRPR组有6 例患者出现缺血事件，22 例患者未出现缺血事件，发生率为21.4%；LRPR 组有13 例患者出现缺血事件，7 例患者失访，166 例患者未出现缺血事件，缺血事件发生率为7.3%。两组缺血不良事件差异有统计学意义（χ2=4.253，P=0.039）。

3 讨论

NSTEMI 是由于心脏血供障碍引起的缺血性心血管疾病，血栓形成是导致缺血事件的重要原因，因此防止血栓形成是临床预防缺血事件再发的重中之重［12-13］。《非ST 段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南（2016）》中强调了NSTEMI治疗中双联抗血小板方案的重要性［10］，该治疗方案可有效防止血栓形成，但依然有部分患者会出现缺血事件。研究显示［14］，HRPR 与急性冠状动脉综合征患者临床缺血事件的发生具有相关性。Ⅱb/Ⅲa 受体、P⁃选择素均与血小板的激活密切相关，但目前研究相对缺乏。

本研究结果显示，HRPR 组患者Ⅱb/Ⅲa 受体（PAC⁃1+）水平明显高于LRPR 组。相关性分析显示Ⅱb/Ⅲa 受体与血小板聚集水平呈正相关，提示Ⅱb/Ⅲa 受体水平与血小板的聚集率密切相关。抑制试验显示加入PAC⁃1 后，血小板的聚集率明显下降，说明HRPR 组患者高血小板聚集率与由高水平的Ⅱb/Ⅲa 受体存在密切的关系。随访发现，HRPR 组患者缺血事件发生率明显高于LRPR组患者，说明高水平的Ⅱb/Ⅲa 受体与PCI 术后缺血事件再发生密切相关，相关研究也显示［15］，2 型糖尿病患者Ⅱb/Ⅲa 受体高表达则预示着发生心血管事件的风险较高。之前的研究显示Ⅱb/Ⅲa抑制剂能够降低氯吡格雷抵抗或阿司匹林抵抗的患者缺血事件的发生［16］，这也可以说明血小板高水平的Ⅱb/Ⅲa 是导致PCI 术后缺血事件再发的重要原因。另一方面，HRPR 组患者的P⁃选择素（CD62p+）水平虽然明显高于LRPR 组，但相关性分析显示P⁃选择素水平与血小板聚集水平无关，且抑制试验进一步证实了血小板聚集率受Ⅱb/Ⅲa 受体水平影响，而与P⁃选择素水平无明显的关系。GOLUKHOVA 等［9］的研究发现PCI 术前血浆中的P⁃选择素水平是PCI 术后HRPR 的危险因素。造成本研究结果与GOLUKHOVA 等不同原因，一方面可能是本文检测的是血小板表面的P⁃选择素的水平，而后者检测的是血浆中P⁃选择素水平，另一方面是两个实验研究的时间节点的不同，本文研究的是PCI 术后双联抗血小板方案治疗后，而后者主要研究的是PCI 术前。更为重要的是，笔者认为P⁃选择素主要介导血小板与中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞及T 淋巴细胞亚群的相互作用，并不直接参与血小板聚集［17］；只有当其与白细胞的相互作用过程中激活Ⅱb/Ⅲa 受体时才能促进血小板的聚集，这也是PAC⁃1+/CD62p+水平与血小板聚集率却有相关性的原因［18］。

综上所述，NSTEMI 患者PCI 术后HRPR 与血小板表面Ⅱb/Ⅲa 受体有关，与P⁃选择素无关。HRPR 可增加NSTEMI 患者PCI 术后缺血事件发生的风险。本研究虽初步验证了HRPR 与血小板表面Ⅱb/Ⅲa 受体的关系，但由于纳入的病例数较少，且为单中心研究，以上结论还有待大型研究进行验证。此外，还需要更多更加深入的基础研究进一步分析血小板表面Ⅱb/Ⅲa 受体影响血小板的聚集率的作用机制，为临床更好的防止NSTEMI患者PCI 术后再发缺血事件提供科学的指导。