负压创面治疗联合脂肪干细胞在慢性创面治疗中的研究进展

朱博恒 张璟琳 汪虹

昆明医科大学第二附属医院烧伤科（昆明 650188）

慢性创面一直是困扰外科医生的一大难题，因为其发病机制复杂、具体诱因多样、治疗难度大，同时对患者的身心健康及生活质量等都产生了严重影响，增加患者的医疗费用，严重时甚至对患者产生生命威胁，给患者家庭和社会造成严重负担，全球各地的医生针对慢性创面也在不断探寻着新的治疗方法。近年来，随着医疗科技的不断发展，已有多种干细胞用于治疗慢性创面，包括脐带干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞等，并且取得了不错的疗效。脂肪干细胞（adipose⁃derived stem cells，ADSCs）是机体存在的一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，其具有来源丰富、损伤小、获得量大、增殖能力强且免疫原性低等独特优势，被认为是组织工程理想的种子细胞之一［1］。负压创面治疗（negative pressure wound therapy，NPWT）起源于20 世纪90年代，又称负压辅助创面愈合技术或负压封闭引流技术，广泛用于创伤、烧伤、骨折、感染、外科手术、糖尿病足等所引起的急慢性创面的治疗［2］。目前，已经有研究者将ADSCs 和NPWT 联合应用治疗慢性创面，取得了不错的临床效果，为慢性创面的治疗提出了新思路。

1 慢性创面的定义

慢性创面又称为难愈合性创面，是指通过正常、有序和及时的修复过程，无法达到解剖和功能完整的创面。在临床上，慢性创面大多是指由于各种原因形成的创面，经过一个月以上的治疗后未能愈合且无愈合倾向者［3］。慢性创面包含感染性创面、术后创面、糖尿病溃疡创面、压疮等，具有病程长、并发症多、对外观影响大等特点，其修复难点在于创面的细胞因子（表皮生长因子、血管生成因子等）分泌不足、局部血液供应不足和细胞外基质合成不足等，同时还伴有炎症反应持续存在，进而导致皮肤细胞功能受损、衰老、修复性干细胞减少以及无法再上皮化和创面修复［4］。目前在临床上对于慢性创面的治疗方法主要有外科清创、敷料覆盖、负压创面治疗、植皮术或皮瓣转移术，但创面总体愈合率较低。近年来也有一些新的治疗方法出现，如干细胞移植、富血小板血浆治疗、基因治疗等。

2 ADSCs 促进创面愈合的机制

ADSCs 是一种从脂肪组织中分离提取得到的间充质干细胞，具有很强的自我更新能力、多向分化潜能和旁分泌功能。ADSCs 主要通过5 个方面来促进创面愈合：（1）调节炎症反应：巨噬细胞作为伤口愈合过程中炎症后期的一部分有两种表型，其中M1 样细胞主要表现为早期促进炎症反应、吞噬病原体和受损细胞；而M2 样细胞主要表现为晚期抗炎反应、促进组织重塑和血管生成。ADSCs 可以通过反式激活精氨酸酶⁃1 诱导抗炎M2 表型、免疫调节抑制巨噬细胞活化、诱导巨噬细胞凋亡等来促进炎症反应减轻，达到了抑制炎症的效果［5-6］。（2）促进血管生成：ADSCs 可分泌大量生长因子，如VEGF、BFGF、HGF、IGF⁃Ⅰ等，这些细胞因子均可以促进血管生成。并且ADSCs 还可以通过外泌体中hsa⁃miR⁃760 的显著上调和hsa⁃miR⁃423⁃3p 的显著下调可以调节ITGA5 和HDAC5基因的表达，从而达到促血管化的目的［7］。（3）调节细胞外基质：ADSCs 可以诱导形成细胞外基质，并分泌大量糖原、黏多糖、蛋白多糖、糖蛋白、和胶原纤维等，从而加强细胞和细胞外基质之间的相互作用［8］。（4）调控成纤维细胞活动：ADSCs 还可以作用于细胞间的信号传导和旁分泌功能等来促进成纤维细胞迁移、增殖和分泌，从而合成大量的胶原纤维、基质成分和肉芽组织等，填补创面组织缺损［9］。（5）促进上皮化：ADSCs 通过增加转化生长因子⁃β1 和纤连蛋白的表达，进而诱导上皮组织再生［10］。因此ADSCs 通过调控炎症反应及细胞外基质的合成、调控纤维细胞的活动、促进血管再生及上皮组织再生来促进创面愈合，但是根据目前大量的研究表明ADSCs 在治疗创面的过程中仍然有一些缺陷：（1）ADSCs 存活率低，尤其是在血液循环不佳的移植部位时；（2）ADSCs 有液化、囊性变等问题；（3）ADSCs 在糖尿病患者中增殖及迁移能力下降、旁分泌功能降低并且一些特异性表面标志物呈现低表达状态。因此如果能解决上述问题将能更好地让ADSCs 运用于创面修复的治疗中。

3 NPWT 促进创面愈合的机制

NPWT 是近些年来的一项新技术，主要通过对创面渗液的持续引流，避免细菌在创面残留，控制感染，减轻肉芽水肿，从而加速创面的愈合［11］。NPWT 主要通过以下5 个方面来促进创面愈合：（1）减轻组织水肿，抑制细菌生长：NPWT 通过在创面上施加负压来清除创面的渗液、坏死组织以及细菌等，并形成密闭缺氧或低氧环境抑制创面细菌的生长繁殖，从而降低细菌含量，减轻组织水肿［12］。（2）促进血管再生，增加创面局部血流：NPWT 可以改善创面氧分压及血管内皮生长因子的表达，并且负压吸引能促进创面微血管直径增大、血流速率增加、内皮细胞增殖、血管床形成增多，改善创面微循环［13］。（3）机械牵拉，收缩创面：NPWT 通过牵拉创面边缘组织向中心移动，创面面积缩小，并引起与创面愈合有关的细胞变形，激活细胞骨架力学信号通路，刺激创面生长因子释放，促进细胞蛋白质生成，诱导创面愈合细胞增殖、迁移和分化，刺激血管生成，增加创面微血管血容量等，从而促进创面愈合［14］。（4）改善微循环，促进肉芽组织形成：NPWT 中一定水平的负压吸引可增加创面毛细血管再生速度，能够改善创面局部血液循环，以及封闭创面形成的湿润环境，均可促进创面肉芽组织生成［15］。（5）调节信号通路，影响细胞因子表达：NPWT 中的负压环境可以促进TGF⁃β、VEGF、PDGF、FGF⁃2 的表达增加，以及增加MMP⁃1、MMP⁃9 的活性和降低TIMP⁃1 水平，并且通过阻碍c Jun 氨基末端激酶信号通路传导，减少白细胞介素⁃6、肿瘤坏死因子⁃α、诱导型一氧化氮合酶等的生成，从而提高创面愈合速度［16］。虽然NPWT 在创面治疗中的优势很明显，但其仍有一些局限性：（1）创面严重感染可能造成治疗失败；（2）创面有焦痂或坏死、创面感染严重、创面严重缺血、创面有活动性出血或机体有凝血功能障碍、创面有血管或神经或肌腱或韧带外露、未治疗的骨髓炎、恶性肿瘤、湿性坏疽等情况下禁止使用NPWT；（3）NPWT 可能存在的并发症：如创面疼痛、感染、出血，局部皮炎、皮疹、皮肤剥脱、皮肤坏死，堵管、引流不畅、创面浸渍、敷料残留等。 因此如果能解决上述NPWT 的局限性将能更好地让NPWT 运用于创面修复的治疗中。

4 ADSCs 与NPWT 联合应用促进创面愈合的作用机理

目前ADSCs 移植治疗创面存在的主要问题就是移植后存活率低，尤其在移植部位血液供应差的情况下，这使ADSCs 应用于创面修复中受到了极大的限制。在早期的研究中CHIN 等［17］通过在小鼠身上放置一种能够预定张力和波形的新型皮肤拉伸装置进行实验，发现所有接受拉伸的小鼠都具有上调的表皮增殖和血管生成，表明适当的皮肤牵拉能够促进表皮的增殖和血管的生成。这项研究在一定程度上为后期研究组织外扩张与脂肪组织内ADSCs 的变化情况奠定了基础，开拓了学者们研究组织外扩张对创面修复研究的新方向。目前已有多位学者通过研究组织外扩张对脂肪组织的作用发现，组织外扩张产生的负压吸引能促进脂肪组织内ADSCs 的增殖。HEIT 等［18］通过连接一个外部体积膨胀装置来治疗小鼠的背部，结果发现外部体积扩张产生的负压诱导皮下脂肪层、脂肪细胞和血管密度的高度增殖，并认为使用外部体积膨胀装置的受体部位准备可能是增强细胞和组织植入的有前途的工具。LANCER⁃OTTO 等［19］通过对小鼠接受小型化的外部体积膨胀装置应用的研究也得出了相似的结论，外部容量扩张产生的负压吸引启动了各种机制，包括机械刺激、水肿、缺血和炎症，这些机制在不同的时间段内维持有利于细胞增殖和血管生成的环境。ORANGES 等［20］将一个由连接到-25 mmHg 抽吸源的橡胶圆顶组成的小型外部体积膨胀装置应用于小鼠的背部并进行刺激，得出结论水肿和炎症与外部体积膨胀的结合产生了促脂肪生成作用。GIORGIO 等［21］通过对50 只小鼠分别接受了5 种不同的间歇性外扩容积应用，得出结论中等强度间歇性体外容量扩张的应用优化了软组织中血管生成和脂肪生成的诱导，而不会造成组织损伤，从而在脂肪移植前具有时间有效的受体部位预处理的潜力。上述四位学者均通过在小鼠模型中使用组织外扩张进行治疗，得出了相似的结论，组织外扩张产生的负压吸引能促进细胞增殖、新血管生成和新脂肪生成。另外，LEE 等［22］在脂肪移植前对20 只白兔的背耳施加负压并持续1 周，通过使用相同的负压进行无创伤口闭合，结果显示预扩张受体部位的血管化增加，从而提高了脂肪移植物的存活率，同样也证明了上述观点。而YE［23］、WEI［24］两位学者均通过建立两种小鼠模型，一种脂肪移植后通过外部容积扩张产生负压吸引，另一种是单纯的脂肪移植，研究得出了相同的结论外部体积扩张通过诱导再生相关细胞的迁移、脂肪细胞的分化及血管生成来提高脂肪组织移植物的存活率，进一步证明了组织外扩张产生的负压吸引能促进脂肪组织内ADSCs 的增殖，并招募更多的宿主来源ADSCs，诱导其成脂分化，最后形成较为穏定且成熟的脂肪组织。上述研究证明NPWT 能够促进ADSCs 移植后新血管生成，从而增强移植处的血液供应情况，进而有效的提高ADSCs 移植后的存活率；并且诱导ADSCs 成脂分化，形成稳定且成熟的脂肪组织；最终能够有效提高ADSCs 治疗慢性创面的疗效，为以后的临床研究奠定了一定基础。

炎症反应是机体对有害刺激的一种自我防御机制，当机体受到病原体的损害或侵袭时，良好的炎症反应调节是创面愈合的基本保障。巨噬细胞作为炎症后期的一部分，是伤口愈合的关键，巨噬细胞刺激血管生成和纤维组织形成的作用已明确。巨噬细胞有两种表型，以肿瘤坏死因子⁃α，白细胞介素⁃1 和白细胞介素⁃6 的产生为特征的M1样细胞在修复的早期阶段很常见，主要表现为促进炎症反应、吞噬病原体和受损细胞，这些炎症对宿主防御很重要，但具有组织破坏性；而M2 样细胞则具有较少的促炎细胞因子和升高的抗炎细胞因子，主要表现为抗炎反应、促进组织重塑和血管生成。目前已有大量研究表明负压吸引可以明显降低创面促炎性细胞因子，从而降低炎性反应。杨帆等［25］通过研究负压封闭引流对兔皮肤创面炎症细胞趋化和炎症因子分泌的影响发现负压吸引可以使创面巨噬细胞计数显著增加，并使肿瘤坏死因子⁃α 及白细胞介素⁃6 计数明显降低而降低炎症反应并使其局限化，促使巨噬细胞向M2 样细胞转变。沈童等［26］通过对糖尿病足患者进行负压创面治疗也得到了相似的结果，NPWT 可显著降低糖尿病足患者血清炎症因子肿瘤坏死因子⁃α、白细胞介素⁃6 水平，从而降低炎症反应，促使巨噬细胞向M2样细胞转变。WANG等［27］通过对22名糖尿病足溃疡患者（11 名接受NPWT 治疗，另外11 名接受传统清创治疗）的研究，发现NPWT 显着降低肿瘤坏死因子⁃α、白细胞介素⁃6 和诱导型一氧化氮合酶的表达，并且其发挥抗炎作用可能是通过抑制IB⁃α 抑制和ATF⁃3 激活引起的促炎酶和细胞因子，这也证明了NPWT 可以降低炎症反应，促使巨噬细胞向M2 样细胞转变。而又有研究表明M2 巨噬细胞能够提高自体脂肪移植物的存活率，PHIPPS等［28］通过将带有盐水或M2 巨噬细胞的移植物注射到受体小鼠头皮下并观察脂肪移植物的体积及血管密度，发现M2 巨噬细胞补充的移植物体积保持稳定、血管密度增加明显，得出结论M2 巨噬细胞通过诱导血管生成提高小鼠模型中自体脂肪移植物的存活率。ETO 等［29］通过研究发现了新的M2 巨噬细胞群体，其表达CD34 和CD206，M2 巨噬细胞具有与脂肪干细胞ASC 相似的特征，包括粘附、定位、形态和间充质多能性，对脂肪组织的维持和重塑很重要。而负压吸引可以促进创面巨噬细胞M2 样转变，因此M2 样巨噬细胞可以向血管内皮细胞及前脂肪細胞分化，从而促进血管形成及脂肪组织再生。综上所述NPWT 可以促进巨噬细胞M2 样转变，然后通过诱导血管生成来提高自体脂肪移植物的存活率，并促进血管形成及脂肪组织再生，进而有效的促进创面愈合。

通过上述多项研究得出负压环境不仅可以增加创面愈合早期阶段的微血管生成数量，还可以促进创面愈合后期产生稳定的环境，并由此促进创面微血管的稳定和成熟，从而改善创面的血流灌注情况，提高移植物的成活率，进而影响创面的愈合情况；自体脂肪干细胞移植能够形成创面修复所需的微环境、促进血管生成及邻近细胞的迁移，从而促进创面愈合；并且二者均可产生大量有助于创面愈合的生长因子。因此将ADSCs 与NPWT 联合应用既可以解决一些单一NPWT 无法解决的慢性创面问题，又可以增加ADSCs 移植后的存活率，还能够相互作用产生更多的生长因子，二者相辅相成，能够更好的用于慢性创面的治疗，给慢性创面又提供了一种新的治疗思路。

5 ADSCs 与NPWT 联合应用促进创面愈合的临床研究

脂肪组织是多能干细胞的主要来源之一，将脂肪组织经抽吸、乳化、离心除去水和油脂后可得脂肪微粒，ADSCs 主要存在于此。漆白文等［30］选取了15 例糖尿病足患者，将自体脂肪微粒覆盖创面，覆盖凡士林纱布，并用VSD 敷料覆盖创面用负压持续吸引2 ～ 3 周，每周更换负压敷料1 次，3 周后拆除VSD 装置，对残存的较大创面行植皮治疗，较小的创面定期换药处理。5 例小面积创面在术后21 ～ 36 d 愈合；10 例较大面积17 ～ 25 d 愈合，在3 ～ 6 个月的随访期间，所有患者伤口依然保持闭合，无并发症存在。在SOUZA 等［31］的研究中，一名59 岁的男性患者自幼患有慢性左胫骨骨髓炎行胫骨远端部分清创术，用于手术伤口初步闭合的后内侧筋膜皮瓣出现部分坏死。皮瓣清创后通过脂肪移植（FG）与NPWT 治疗，经过三周的治疗，肉芽组织覆盖了所有的创面，然后通过皮肤移植使伤口完全愈合，该研究表明这种新疗法有效。在BIYAO 等［32］的研究中，一名65 岁女性患者右脚有严重糖尿病足溃疡，进行了外科清创术、自体脂肪移植（AFG）和NPWT 联合应用，治疗一段时间后肉芽组织覆盖整个伤口，然后通过分层皮肤移植闭合伤口。术后1 个月，患者糖尿病足溃疡完全愈合并且无复发，这也证明了联合使用AFG 和NPWT 的疗效。杨昭伟等［33］筛选了慢性创面患者15 名，实验组8 例使用ADSCs 及NPWT 联合治疗，对照组7 例单独使用NPWT 治疗，治疗10 d 后实验组的创面愈合率、真皮层胶原沉积、新生血管数量均高于对照组，这项研究证明ADSCs 及NPWT 联合治疗的临床效果是积极明显的。综上所述，上述几项研究证明了ADSCs 及NPWT 联合治疗具有创伤小、临床可行性强等优点，能有效促进慢性创面的愈合，并且相对于单一的ADSCs 或NPWT 治疗慢性创面效果更佳，是治疗慢性创面安全而有效的一种新方法，并且有望通过这种新的治疗方法去解决一些使用单一ADSCs 或NPWT 治疗方法无法解决的一些慢性创面问题，在给患者带来更好的治疗方法的同时还为临床工作者们打开了思路：可以将多种单一的治疗方法相结合可能会有更好的疗效。

6 总结与展望

综上所述，ADSCs 与NPWT 联合使用可有效促进慢性创面的愈合，并且疗效显著。ADSCs 来源广泛，取材方便，对供区损伤极小，且伦理学限制较少，并且免疫排斥反应也较少，临床应用前景广阔。NPWT 能有效提高慢性创面愈合率、缩短愈合时间、降低不良风险，尤其适用于不能耐受多次手术清创的患者。二者联合使用达到了相辅相成的作用，既解决了单一NPWT 无法解决的慢性创面，又有效的提高了ADSCs 的存活率，并促进血管形成及脂肪组织再生，还能够相互作用产生更多的生长因子，较单一的ADSCs 或NPWT 治疗均有明显的疗效提升，是治疗慢性创面安全而有效的一种新方法。然而为了更进一步评估该治疗的有效性，还需要进行ADSCs 和NPWT 联合应用与单一方法治疗创面相对比的大样本随机对照临床试验。除此之外，在大量ADSCs 和NPWT 联合应用的研究中，对于ADSCs 的分离提取没有标准化方案，联合使用时负压吸引的压力最佳值是多少也不统一。希望未来有更多的学者致力于研究ADSCs 与NPWT 联合使用治疗慢性创面，使这种治疗方案能够更早、更广泛的在临床上得到应用。