QuEChERS/高效液相色谱－串联质谱法测定黄金罗汉果中50种常用农药残留

2023-01-05陈俊妃谢思敏顾利红

分析测试学报 2022年12期

李纯，陈俊妃，熊颖，谢思敏，顾利红

（国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广州市药品检验所，广东广州 510160）

罗汉果为葫芦科植物罗汉果Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey ex A.M.Lu&Zhi Y.Zhang的干燥果实［1］，具有清热润肺、利咽开音、滑肠通便的功效，是国家卫生部首批批准的药食两用的品种之一。黄金罗汉果是新鲜罗汉果采摘后采用真空微波工艺脱水处理的成品，表面呈金黄色，故称“黄金罗汉果”。与传统烘烤干燥的罗汉果相比，黄金罗汉果中更多营养物质得以保存，更符合现代健康环保的理念。

通过查阅《中国农药信息网》数字平台的农药登记数据发现，目前尚未有罗汉果种植中使用的农药登记品种，罗汉果行业标准（NY/T 694－2003）［2］仅收载了4种有规定最大残留限量的农药。《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763－2021）［3］也未规定罗汉果中农药的最大残留限量（MRL）。根据2019年4月“农业农村部办公厅关于印发《用药短缺特色小宗作物名录》、《特色小宗作物农药登记药效试验群组名录》和《特色小宗作物农药登记残留试验群组名录》的通知”［4］，“罗汉果”归类在用药短缺特色小宗作物名录（2019版）药用植物的“果实、种子类”，该药用植物的“果实、种子类”代表作物为枸杞，枸杞目前已登记使用的农药有23种。为控制农药残留，建立黄金罗汉果中常用农药多残留的检测方法尤为重要。

与气相色谱法、液相色谱法相比，QuEChERS技术结合色谱－串联质谱检测方法具有专属性好、灵敏度高和适用范围广等特点，已被广泛应用于乳制品、中药、茶叶和蔬果等基质中农药的检测［5－9］，但目前适用于黄金罗汉果中多类别农药残留检测的方法尚未见报道。王梦月等［10］采用气相色谱法测定罗汉果中的有机氯农药；秦富等［11］采用QuEChERS－高效液相色谱－串联质谱法测定罗汉果中55种杀菌剂；陈晓兰等［12］采用QuEChERS－气相色谱法测定罗汉果中的哒螨灵；潘艳坤等［13］采用固相萃取/高效液相色谱检测罗汉果及其提取物中的甲基托布津与多菌灵。本研究基于实地调研，以改良的QuEChERS技术结合高效液相色谱－串联质谱（HPLC－MS/MS），建立了黄金罗汉果中涵盖6类用途共50种常用农药的检测方法，并对基地收集的28批样品进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC－30A高效液相色谱仪－8050三重四极杆质谱仪（日本Shimadzu公司）；AG245型电子分析天平（瑞士Mettler－Toledo公司），Millipore超纯水处理系统（德国Merck公司），ST 16型高速离心机（美国Thermo公司），Maxi Mix II旋涡仪（美国Thermo公司），N－EVAP氮吹仪（美国Oganomation公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；甲酸、甲酸铵、冰乙酸（色谱纯，上海安谱有限公司）；无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末盐包（质量比4∶1，7.5 g，美国Waters公司）；无水硫酸镁、N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm）、石墨化炭黑（GCB，30～90 μm）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18，50 μm，60Å）（农残级，上海安谱有限公司）。分散型净化材料管（美国Dikma公司）。农药化合物标准品（Dr.Ehrenstorfer、ANPEL、BePure、O2SI公司）。

课题组共收集黄金罗汉果样品28批，均为2020～2021年采收，产地分别为广西桂林（16批）、湖南郴州（7批）与贵州黔东南苗族侗族自治州（5批），经广州市药品检验所顾利红主任中药师鉴定为葫芦科植物罗汉果的干燥果实。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制及标准曲线绘制混合标准品储备溶液：精密量取50种农药对照品溶液（100 mg/L）各1 mL，置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容制备成混合标准品储备溶液，于-30℃冰箱中保存。

混合标准品工作溶液：精密量取混合标准品储备液25 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容制备成混合标准品工作溶液。临用前现配。

基质匹配标准工作溶液：分别取不含待测农药的罗汉果样品9份，按“1.2.2”处理至“置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4 mL”，分别加入混合标准品工作溶液20、40、100、200、300、400、600、800、1 000 μL，用乙腈稀释并定容至2.0 mL，配制系列质量浓度的基质匹配标准工作溶液。

分别量取基质匹配标准工作溶液及经“1.2.2”处理的样品溶液，过微孔滤膜（0.22 μm），按“1.2.3”条件测定，以各农药的质量浓度（X，ng/mL）为横坐标，以各农药定量离子峰的峰面积响应值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，权重系数选择1/X，得到50种农药的回归方程及相关系数。

1.2.2 样品前处理取供试品粉末（过三号筛）3 g，精密称定，置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入15 mL水，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，精密加入1%乙酸乙腈15 mL，涡旋混匀，置振荡器上剧烈振荡（500次/min）5 min，于冰浴中冷却10 min，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末（4∶1）7.5 g，立即摇散，置振荡器上剧烈振荡（500次/min）3 min，离心（4 000 r/min）5 min。取9 mL上清液，置于分散固相萃取净化管（装有无水硫酸镁900 mg，PSA 450 mg，C18300 mg，GCB 50 mg）中，涡旋充分混匀，置振荡器上剧烈振荡（500次/min）5 min使净化完全，离心（4 000 r/min）5 min，精密吸取5 mL上清液，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈稀释至2.0 mL，即得。

1.2.3 分析条件色谱条件：Agilent Poroshell 120 EC－C18色谱柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；柱温：35℃；样品盘温度：10℃；流动相：A为0.05%甲酸水溶液（含10 mmol/L甲酸铵），B为95%甲醇（含10 mmol/L甲酸铵和0.05%甲酸）。梯度洗脱程序：0～1 min，95%A；1～4 min，95%～40%A；4～8 min，40%～36% A；8～8.5 min，36%～32% A；8.5～9 min，32%～25% A；9～16 min，25%～5% A；16～20 min，5%A；20～20.1 min，5%～95%A；20.1～25 min，95%A。流速：0.4 mL/min；进样体积：2 μL。

质谱条件：电喷雾（ESI）离子源；扫描方式：正负离子同时扫描；检测模式：多反应监测模式（MRM）；雾化气流速：1.5 L/min；加热气流速：10 L/min；接口温度：300℃，脱溶剂温度：500℃，DL温度：180℃，加热块温度：400℃；干燥气流速：10 L/min。50种农药的保留时间、离子对、碰撞能量见表1。

表1 50种农药的保留时间、离子对及碰撞能量Table 1 Retention times，ion pairs and collision energies of 50 pesticides

（续表1）

2 结果与讨论

2.1 农药目标物的选择

本文的50种农药目标物主要包括：①实地调研中发现的罗汉果种植基地及周围环境中可能使用的农药；②枸杞子品种中有登记使用的农药；③罗汉果行业标准（NY/T 694－2003）中规定最大残留限量的农药；④具有毒理学意义的代谢产物及异构体。从化学结构上分析，主要为有机磷类（13种）、氨基甲酸酯类（5种）、三唑类（10种）、杂环类（18种）、其他（4种）。从农药用途上分析，包括杀虫剂（25种）、杀菌剂（13种）、杀螨剂（6种）、植物生长调节剂（3种）、毒性代谢物（2种）、除草剂（1种）。

2.2 检测条件的优化

50种农药中大多数化合物适合质谱正离子模式检测，但部分化合物（虱螨脲、氟虫胺、除虫脲）在负离子模式下的响应更好，因此采用正负离子同时扫描的质谱检测方式。为使温度敏感型农药化合物（如丁硫克百威）在分析过程中保持稳定，样品盘温度选择为10℃。

对50种农药混合标准溶液（100 ng/mL）在m/z30～900范围内进行全扫描，并调整目标物的母离子、子离子、碰撞能量等质谱参数，同时加入罗汉果空白基质进行优化。每个化合物选择同时监测2组MRM离子对作为定性离子对，选择响应值高且干扰少的离子对作为定量离子对，并设定每个化合物的采集时间窗为1 min，显著降低样品中多组分分析的循环时间，增加采集点，提高仪器响应值。黄金罗汉果空白基质匹配的50种农药混合标准溶液（10 ng/mL）的总离子流色谱图见图1。

图1 黄金罗汉果空白基质匹配的50种农药混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of 50 pesticide mixed standard solutions matched with blank matrix of golden siraitia grosvenoriis

2.3 前处理方法的优化

50种农药的pKa为1.0～14.4，涵盖酸性、中性及弱碱性农药，理化性质差异较大。QuEChERS法通常采用1%乙酸水溶液先对样品进行浸泡，但部分酸碱度敏感型农药可能容易降解。实验比较了10 LOQ加标水平下，分别采用1%乙酸水溶液－乙腈与水-1%乙酸乙腈作为提取溶剂时50种农药的回收率。结果显示，采用水-1%乙酸乙腈的平均回收率（95%）整体略高于1%乙酸水溶液－乙腈（89%），且部分弱碱性农药的回收率显著提高，例如乙酰甲胺磷（pKa 11.0）的回收率由47.0%增至80.0%，霜霉威（pKa 12.7）由22.0%增至65.0%，吡蚜酮（pKa 12.9）由45.0%增至67.0%，氧乐果（pKa 14.4）由55.0%增至81.0%。因此选择水-1%乙酸乙腈为提取溶剂。

QuEChERS法的净化材料主要包括PSA、C18、GCB、无水MgSO4。其中，无水MgSO4可去除多余的水分。PSA可去除酸性及中性物质（例如有机酸、脂肪酸、酚类等），其净化效果与含水量有关，含水量越高，净化效果越差。C18可去除非极性有机物（如木质素、萜类等）。GCB去除色素的能力较强，同时也容易吸附部分平面结构的化合物［8］。罗汉果提取液含有糖类、色素、黄酮类等，经过液液分层，大部分色素与糖类留在水层。参考《中华人民共和国药典》2020年版［1］，并在前期研究的基础［14－16］上对净化步骤进行优化。固定无水MgSO4用量为900 mg，以10 LOQ加标水平进行考察，对比了PSA、C18、GCB净化材料3种用量配比时的回收率。3种用量配比分别为：①300 mg PSA、300 mg C18、90 mg GCB；②300 mg PSA、450 mg C18、90 mg GCB；③450 mg PSA、300 mg C18、90 mg GCB。结果显示，上述3种配比下50种农药的平均回收率分别为85.0%、91.0%、94.0%，总体差异不大，但部分平面结构化合物（如多菌灵、伏杀硫磷等）的回收率低于50.0%，原因可能是GCB含量太高。而采用配比③，再将GCB用量降至50 mg，多菌灵、伏杀硫磷等农药的回收率提高至70.0%以上，95%农药的回收率在70.0%～120%范围内，满足残留分析要求。因此净化剂确定为450 mg PSA、300 mg C18、50 mg GCB。

2.4 基质效应考察

质谱分析中待测物不可避免地会受到基质效应的影响。实验采用绝对法［17－18］评价基质效应（Matrix effect，ME），计算公式为ME（%）=100%×B/A，其中A为纯溶剂中待测物标准品溶液的平均响应值，B为空白基质中相同浓度的待测物标准品溶液的平均响应值。当ME为85%～115%时，表明基质效应较弱，对结果的影响可忽略；当ME＞115%或＜85%时，表明存在基质增强或抑制效应，应采用适当方法进行校准。比较了质量浓度为10 ng/mL的溶剂标准溶液与罗汉果基质标准溶液的响应值。结果显示，有44种农药的ME为85%～115%，表明其影响可忽略；氧乐果受基质抑制影响严重（ME＜50%）；吡虫啉、伏杀硫磷、霜霉威、多菌灵受基质抑制影响轻微（60%＜ME＜85%）；毒死蜱受基质增强影响轻微（ME＞115%）。为保证实验结果的准确性，采用基质匹配标准溶液进行定量分析。

2.5 方法学考察

按照“1.2.1”方法绘制标准曲线，结果显示，乙酰甲胺磷在10～500 ng/mL，鲜胺酯、氯吡脲、呋虫胺、噻虫嗪、异草松在6～300 ng/mL，丙环唑在7.5～375 ng/mL，其余43种农药在5～250 ng/mL 范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.99。按照定量离子对MRM色谱峰的信噪比S/N≥10确定定量下限（LOQ），除乙酰甲胺磷、丙环唑的LOQ为0.02 mg/kg外，其余48种农药的LOQ均为0.01 mg/kg。

在罗汉果空白样品中分别添加2 LOQ、5 LOQ、20 LOQ、40 LOQ的50种农药混合标准溶液，静置30 min，待农药被样品充分吸收后，按“1.2.2”方法处理并进行回收实验。每个水平平行处理3份，回收率及相对标准偏差（RSD）见表2。结果显示，4个加标水平下50种农药的平均回收率为60.7%～115%，90%以上农药的回收率为70.0%～120%，涵盖全部有检出值的农药，95%以上农药的RSD（n=3）小于15%，符合农药多残留的检测要求［19］。

表2 50种农药的相关系数、定量下限、回收率和相对标准偏差Table 2 Correlation coefficients，LOQs，average recoveries and RSDs of 50 pesticides

（续表2）

2.6 实际样品测定

采用本方法测定28批黄金罗汉果，结果显示，共有21批次样品（占75%）检出10种农药。农药残留量为0.01～0.27 mg/kg，最高检出量为吡唑醚菌酯，其残留量为0.27 mg/kg（1批次），其余检出量均低于0.1 mg/kg，说明黄金罗汉果中农药残留量总体不高（见表3）。根据枸杞子已登记的农药范围，有5种检出的农药并未进行登记，分别为虱螨脲、丙溴磷、毒虫畏、霜霉威、乙拌磷亚砜，表明黄金罗汉果种植中存在超范围使用农药的现象。