高效液相色谱－串联质谱法检测配合饲料中11种蛋白同化激素含量

2023-01-05贡松松张浩然陈思思吴剑平

分析测试学报 2022年12期

王博，张婧，贡松松，张浩然，徐汀，陈思思，吴剑平，严凤

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

蛋白同化激素俗称合成类固醇，是一类拟雄性激素的人工合成的甾体激素，用药后易吸收，血中浓度高，体内活性大，具有促进蛋白质合成和抑制蛋白质异化，增加食欲、增长肌肉、增加体重及增强体质等多种作用［1－2］。因此有不法商家在肉用畜禽饲料中添加此类激素以提高产量和品质，但这些激素会通过肉、奶、蛋等副食品向人体内迁移蓄积，长期食用会导致肝功能障碍，儿童性早熟，异性特征显现，内分泌紊乱，甚至诱发一些腺体肿瘤［3－5］。

国内在2008年制定了GB/T 22260－2008《饲料中甲基睾丸酮的测定高效液相色谱串联质谱法》［6］，但检测药物只有1种，而同年发布的农业部公告1068－3－2008《饲料中10种蛋白同化激素的测定液相色谱－串联质谱法》［7］中涵盖了10种常用蛋白同化激素，但检测的蛋白同化激素只有4大类。根据生化结构与化学合成方法，常用的蛋白同化激素可分为睾酮衍生物、雄烷衍生物、诺龙衍生物、杂环衍生物、杂类合成类固醇5大类，现有检测标准均不能满足实际检测要求。自1988年起，欧盟就已禁止动物源性食品中使用激素，日本规定牛肉中雌三醇、孕酮的最大残留限量（MRL）为0.01 mg/kg，美国规定牛肉、羊肉中孕酮的MRL为0.003 mg/kg，韩国规定牛肉中孕酮的MRL也为0.003 mg/kg［8］。

国内外有较多关于蛋白同化激素含量检测的文献，检测方法多为液相色谱－质谱法［9－12］、气相色谱－质谱法［13－16］，检测对象多为血清［17－18］、动物组织［19－20］和尿液［21－22］，关于饲料中蛋白同化激素的研究较少。饲料基质复杂，基质效应明显，已有标准采用基质匹配方法进行定量，但操作繁琐不便于推广。本文以睾酮衍生物（睾酮、甲基睾酮、勃地龙）、雄烷衍生物（美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮）、诺龙衍生物（诺龙、丙酸诺龙）、杂环衍生物（司坦唑醇）和杂类合成类固醇（美伦孕酮、黄体酮）5大类蛋白同化激素为研究对象，建立了同时检测配合饲料中11种蛋白同化激素的高效液相色谱－串联质谱法，采用内标法辅助定量，能很好弥补国内外的研究空白。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC－XEVO－TQ－MS高效液相色谱串联四极杆质谱（美国Waters公司）；离心机（德国Beckman公司）；万分之一电子天平（瑞士梅特勒－托利多仪器有限公司）；旋涡振荡器（北京Targin公司）；氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；Milli－Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，德国默克公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美国J.T.Baker公司）；睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮、诺龙、丙酸诺龙、司坦唑醇、美伦孕酮、黄体酮、睾酮－D3、甲基睾酮－D3、勃地龙－D3、美雄酮－D3、雄烯二酮－D7、脱氢异雄酮－D2、诺龙－D3、丙酸诺龙－D3、司坦唑醇－D3、美伦孕酮－D3、黄体酮－D9（德国Dr.Ehrenstorfer公司）。饲料样品均来自市面收集，于3℃下保存。

1.2 标准溶液的配制

11种蛋白同化激素混合标准储备液（1 mg/mL）：称取各蛋白同化激素对照品10 mg，用乙腈定容于10 mL容量瓶中；11种同位素内标混合储备液（1 μg/mL）：准确量取各同位素内标母液（100 μg/mL）100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容。标准溶液均置于-20℃保存，备用。

1.3 样品前处理

称取试样1 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，准确加入100 μL内标溶液和20 mL乙腈，以1 500 r/min振荡提取20 min，9 000 r/min离心5 min。取3 mL上清液至50 mL离心管中，加入100 mg PSA粉，涡旋1 min，9 000 r/min离心5 min，取2 mL上清液至10 mL离心管中，于50℃下用氮气吹干，用1 mL 50%乙腈溶液溶解，涡旋混匀，经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。

1.4 测定条件

色谱条件：色谱柱：Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；流动相：A为乙腈，B为0.01%甲酸溶液；梯度洗脱程序：0～2 min，40%A；2～5 min，40%～100%A；5～6 min，100%A；6～6.1 min，100%～40%A；6.1～7.5 min，40%A。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式扫描；载气：800 L/min；反吹气：3 L/min；雾化气温度：500℃；电离电压：3.5 kV；离子源温度：150℃。各目标物的采集离子对信息及质谱条件见表1。

表1 各目标化合物和内标的质谱碎片离子信息、锥孔电压、碰撞能量及保留时间Table 1 Mass spectral fragment ion informations，cone voltages，collision energies and retention times of analytes and their internal standards

2 结果与讨论

2.1 色谱－质谱条件的优化

ESI+离子化模式下，在m/z50～1 000范围内进行一级质谱全扫描，得到11种目标物的总离子色谱图，选择2个离子作为定性离子，选择响应高且无杂质干扰的1个离子作为定量离子，各目标物的母离子和子离子见表1。比较其提取离子色谱图的响应和峰形，依次优化得到各参数如“1.4”所示。

以Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）为分离色谱柱，分别考察了甲醇-0.1%甲酸（40∶60，体积比，下同）、甲醇-0.1%甲酸（80∶20）、乙腈-0.1%甲酸（60∶40）、乙腈-0.1%甲酸（40∶60）、乙腈-0.05%甲酸（40∶60）、乙腈-0.01%甲酸（40∶60）、乙腈-水（40∶60）为流动相时对目标物响应的影响。结果显示，当流动相有机相为甲醇时，部分目标物的峰形较差，响应较低，可能是因为部分目标物难溶于甲醇；当流动相不含酸时，丙酸诺龙的响应差，当流动相中含少量酸时，各目标物的峰形好，响应高，因此选用乙腈-0.01%甲酸（40∶60）作为流动相。同时对流速、色谱柱温度等条件进行优化，确定色谱条件如“1.4”所示。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择向空白猪配合饲料中添加11种蛋白同化激素标准品，考察了分别以甲醇、30%甲醇、乙腈、30%乙腈、乙酸乙酯为提取溶剂时的提取效果。结果表明，以乙腈和乙酸乙酯为提取溶剂时的提取效率相对较高，这可能是因为部分目标物不溶于水或甲醇所致。考虑到后续实验操作的简便性，选择乙腈作为提取溶剂。

2.2.2 净化条件的选择向空白猪配合饲料中添加11种蛋白同化激素标准品，经乙腈提取后，分别选择常用的SPE法（分别为HLB（60 mg/3mL）、PRIME HLB（60 mg/3mL）、MCX（60 mg/3 mL）固相萃取柱）、正己烷液液萃取法和QuEChERS法进行净化条件考察。结果发现，使用SPE法净化时司坦唑醇较难洗脱，可能是因为甾醇类药物易被吸附；使用正己烷液液萃取净化时，正己烷会将一部分蛋白同化激素除去，造成损失。因此采用QuEChERS法净化，分别对比了酸性Al2O3、C18和PSA粉3种净化剂的效果，发现选择酸性Al2O3时司坦唑醇约有40%被吸附，选择C18粉时会造成部分目标物损失，而选择PSA粉时能较大提高丙酸诺龙的提取效率，且对其余目标物影响不大。因此，实验选择PSA粉作为净化条件。

2.3 方法学验证

2.3.1 基质效应基质效应是指在样品测试过程中，待测物以外的其他物质直接或间接影响待测物响应的现象，从而影响定量分析的可靠性和准确性。基质效应可通过下式评价：ME（%）=基质溶液中分析物的峰面积/纯溶剂中分析物的峰面积×100%。当ME在85%～115%之间，表明不存在基质效应；当ME大于或小于85%时，表明存在基质效应。实验分别比较了不同空白猪配合饲料和鸡配合饲料基质中添加100 μg/kg蛋白同化激素标准品的检测结果。如图1所示，11种蛋白同化激素的ME值为51.6%～105%，表明基质对部分目标物检测有抑制作用。消除基质效应的常见方法有基质匹配标准曲线法、内标法，本实验选择内标法辅助定量。

图1 11种蛋白同化激素的基质效应Fig.1 Matrix effects of 11 anabolic androgenic steroids

2.3.2 标准曲线精密移取适量11种蛋白同化激素标准储备液，加入适量内标，用50%乙腈溶液稀释成质量浓度分别为1、5、10、50、100 ng/mL的标准曲线系列工作溶液（内标质量浓度为10 ng/mL），在优化的色谱和质谱条件下进行测定。

以蛋白同化激素和同位素内标质量浓度的比值为横坐标（X），蛋白同化激素和同位素内标的峰面积比值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。结果显示，各蛋白同化激素在1～100 ng/mL范围内线性良好，相关系数（r2）均为0.999。

2.3.3 检出限与定量下限在上述空白猪配合饲料和鸡配合饲料中添加一定浓度的蛋白同化激素对照品，按照本方法进行测定，分别以3倍和10倍信噪比（S/N）对应的质量浓度为检出限和定量下限。确定本方法的检出限为20 μg/kg，定量下限为50 μg/kg。空白鸡配合饲料中添加50 μg/kg的特征离子质量色谱图见图2。

图2 空白鸡配合饲料中添加50 μg/kg的色谱图Fig.2 Chromatograms of blank chicken compound feed added 50 μg/kg

2.3.4 回收率与相对标准偏差选取9类空白饲料样品进行加标回收率及精密度实验，样品分别添加50、250、500 μg/kg 3个浓度水平的标准溶液，每个浓度平行测定5次，计算平均回收率及相对标准偏差（RSD），其中，鸡配合饲料和猪配合饲料的结果分别见表2和表3。3个加标水平下，鸡配合饲料中各蛋白同化激素的回收率为94.5%～111%，日内RSD为1.2%～13%，日间RSD为1.4%～13%；猪配合饲料中各蛋白同化激素的回收率为90.1%～109%，日内RSD为1.5%～9.0%，日间RSD为1.6%～8.8%。结果均符合GB/T 23182－2008《饲料中兽药及其他化学物检测试验规程》［23］的要求。

表2 鸡配合饲料中11种蛋白同化激素的回收率及相对标准偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 11 anabolic androgenic steroids in chicken compound feed（n=5）