骨形态发生蛋白15调控卵泡发育及与生殖内分泌疾病的关系

陈明丽，赵晓丽，冯伟华，夏天

卵泡的发育是涉及神经、内分泌等多种因素的高度协调过程，其发育异常参与了多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）等生殖内分泌疾病的发生[1-2]。近年来卵巢局部产生的细胞因子对卵巢功能的调节作用逐渐受到关注，这些细胞因子通过自分泌和（或）旁分泌的形式介导卵泡微环境中颗粒细胞与卵母细胞之间的交流对话，促进卵泡发育、颗粒细胞增殖分化，尤其在卵泡生长早期起着重要的作用。骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）作为卵母细胞分泌因子（oocytesecreted factor，OSF）以旁分泌的形式广泛参与卵泡发育、颗粒细胞增殖与凋亡、类固醇生成、排卵以及黄体化等过程[3-4]。BMP15可促进卵母细胞发育成熟，促进颗粒细胞增殖和分化，调控卵泡闭锁，并参与多种生殖内分泌疾病的发生。因此，现对BMP15调节卵泡发育的机制及与相关生殖内分泌疾病的最新研究进展进行综述。

1 BMP15的结构与表达

BMP15又称为生长分化因子9B（growth differentiation factor 9B，GDF9B），属于BMP家族（BMPs）的一员。BMP15基因（OMIM 300247）定位于人X染色体的Xp11.2，由2个编码蛋白的外显子和1个非编码的内含子构成，被认为是首个卵巢决定基因。BMP15蛋白以前肽前体的方式合成，随后以同源或异源二聚体的形式加工和分泌。BMP15先被翻译为包含1个氨基（N）端信号肽，1个前结构域和1个羧基（C）端成熟结构域的前体蛋白，在去除信号肽后，前体蛋白发生二聚化并在保守的蛋白酶水解位点（RXXR）被前转化酶进一步切割，最终形成成熟的二聚化功能蛋白并分泌至卵泡液中。由于缺乏共价键连接的半胱氨酸残基，BMP15主要以同二聚体或异二聚体的形式发挥作用。研究表明，BMP15与其高度同源的GDF9以非共价键连接的形式形成异二聚体“cumulin”，在调控颗粒细胞功能与改善卵母细胞质量方面发挥重要作用[5]。

BMP15高表达于生长期的卵母细胞，其表达量有物种和时空差异。在人类，BMP15在胚胎时期的始基卵泡阶段即开始表达，并一直持续到排卵前。此外，BMP还表达于颗粒细胞和间质细胞[6]。

2 BMP15参与的信号通路

BMP15主要依赖于经典的Smad信号通路发挥功能。BMP15以成熟的二聚体形式首先在颗粒细胞膜表面与2种特定组合的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，即Ⅱ型受体骨形态发生蛋白受体2（bone morphogenetic protein receptor type Ⅱ，BMPR2）与Ⅰ型受体激活素受体样激酶6（activin receptor-like kinase 6，ALK6），随即磷酸化细胞内转录因子Smad1/5/8，并最终与Smad4形成一个三聚体复合物易位至细胞核，通过与特定转录因子相互作用共同活化或抑制下游基因的表达。除了经典的Smad信号通路，许多非Smad依赖性通路也参与BMP15信号的活化。如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路，主要涉及细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38/MAPK等信号分子，不同信号通路之间的串扰共同形成一个BMPs信号网络，共同调节卵泡的发育与闭锁。

3 BMP15的生理功能

3.1 促进卵母细胞发育BMP15促进卵母细胞的发育、成熟，并改善后续胚胎发育。研究表明，在牛卵母细胞体外成熟（in vitro maturation，IVM）期间，添加BMP15可显著提高卵母细胞发育潜能，增加成熟卵母细胞的数量，并能提高后续卵裂率及囊胚质量，促进胚胎发育[7-9]。Dey等[10]认为BMP15协同GDF9不仅能促进卵母细胞核与细胞质成熟，还能防止透明带硬化，促进正常受精并改善胚胎发育。

BMP15通过协同双调蛋白（amphiregulin）、上调卵丘扩张相关基因的表达，促进卵母细胞代谢及营养供应，提高卵母细胞发育潜能。双调蛋白作为表皮生长因子样肽的一种，能够促进卵母细胞减数分裂恢复，促进卵母细胞成熟。卵母细胞的发育离不开扩张卵丘细胞的营养供应，卵丘细胞由颗粒细胞分化而来，其包绕在卵母细胞周围并与卵母细胞紧密接触，调控卵母细胞的生长发育。研究表明，BMP15与双调蛋白相互作用，可促进代谢物从卵丘细胞的间隙连接转移到卵母细胞，从而增强卵母细胞的发育潜能[11]。此外，BMP15还可通过上调透明质酸酶2（hyaluronan synthase 2，HAS2）、肿瘤坏死因子α诱导蛋白6（tumor necrosis factor alpha-induced protein 6，TNFAIP6）与前列腺素合成酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）等基因的表达促进卵丘细胞扩张，扩张的卵丘细胞通过增强卵母细胞所需的营养供应，促进卵母细胞减数分裂成熟，提高卵母细胞质量[12]。此外，BMP15可作为预测卵母细胞成熟的指标[13]。

3.2 促进颗粒细胞增殖分化体外实验已证实BMP15可促进颗粒细胞的增殖分化，具有促有丝分裂的作用[14]。BMP15可通过Smad和非Smad途径上调卵泡刺激素受体（follicle -stimulating hormone receptor，FSHR）的表达，增加颗粒细胞对卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）的敏感性，从而促进颗粒细胞的增殖分化。一方面，BMP15通过磷酸化Smad1/5/8，增加FSHR启动子区域的组蛋白乙酰化，调控其染色质结构，使其更易被转录因子上游刺激因子1/2（upstream stimulatory factors 1 and 2，USF1/2）结合；另一方面，BMP15还可通过激活非经典的p38/MAPK通路直接上调FSHR的关键转录因子USF1/2[15]。

此外，BMP15可通过Kit配体及其受体（Kit ligand receptor，c-kit）信号介导卵母细胞与颗粒细胞之间的交流，促进颗粒细胞增殖。BMP15可直接刺激颗粒细胞中Kit配体的表达，同时与卵母细胞表达的c-kit信号相互作用，通过促进颗粒细胞的有丝分裂促进颗粒细胞增殖。颗粒细胞表达的Kit配体可与卵母细胞表面的c-kit结合，以抑制卵母细胞中BMP15的分泌。因此BMP15与Kit配体的负反馈系统可介导卵母细胞与颗粒细胞之间的交流，并能够促进颗粒细胞增殖分化，在卵泡发生早期起着重要的作用[16]。

3.3 抑制卵泡凋亡卵泡凋亡是卵泡闭锁的内在机制，卵泡闭锁在卵泡发育的任何阶段均可发生，是卵泡的一种退化过程，对维持和调控卵泡内环境稳态具有重要的作用。在哺乳动物中，绝大部分的卵泡均会发生闭锁，只有不到1%的卵泡发育为优势卵泡并最终排卵。一般认为，卵泡闭锁始于颗粒细胞凋亡，促凋亡因子与促生存因子之间的微妙平衡决定着卵泡最终的命运。

体外实验证明，BMP15具有抗卵丘细胞凋亡的作用[17]。卵丘细胞是一种特殊的颗粒细胞，其围绕在卵母细胞周围并向其输送生存所需营养物质及代谢物，卵丘细胞凋亡导致卵母细胞代谢受损、发育停滞和卵泡闭锁。BMP15可以通过上调抗凋亡因子B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、下调促凋亡因子B细胞淋巴瘤2相关X蛋白（Bax）的表达，抑制卵丘细胞凋亡，促进颗粒细胞生存[17]。自杀相关因子（factor associated suicide，Fas）/Fas配体（Fas ligand，FasL）是介导颗粒细胞凋亡的主要信号通路，BMP15能通过趋化因子配体2（chemokine ligand 2，CCL2）介导的Fas/FasL通路抑制猪卵丘细胞的凋亡，其还可通过抑制凋亡相关基因原纤维蛋白1（fibrillin1，FBN1）的表达促进卵丘细胞增殖[18]。叉头框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）作为颗粒细胞凋亡效应物，在氧化应激条件下可显著增强颗粒细胞凋亡率。研究表明，BMP15可能通过下游Smad4信号抑制颗粒细胞中FOXO1的表达，从而起到抗颗粒细胞凋亡的作用[19]。

3.4 调节类固醇激素生成BMP15可抑制孕酮的过早产生，预防卵泡过早黄体化。过早黄体化是辅助生殖领域中的热点问题。临床上为了实现多卵泡发育，高剂量FSH的使用可通过刺激相关酶的活性，如3β-羟基类固醇脱氢酶（3 β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD/HSD3B1），促进孕烯醇酮转化为孕酮，造成孕酮的过早升高[20]，导致过早黄体化的发生。BMP15可通过下调FSHR，阻碍相关FSH依赖性基因，如P450侧链裂解酶（P450 side chain cleavage enzyme，P450scc/CYP11A1）、3β-HSD/HSD3B1 和LH受体（luteinizing hormone receptor，LHR）的表达，从而抑制FSH诱导的孕酮过早产生[21]，有利于防止种植窗前移，保证胚胎发育与子宫内膜容受性的同步，促进胚胎植入和妊娠维持。类固醇生成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）作为胆固醇转化为孕烯醇酮的关键酶，是黄体化的重要标志。Chang等[22]认为BMP15可以通过ALK3介导的Smad1/5/8通路下调StAR的表达，降低孕酮的产生，在卵泡发育的晚期阶段抑制卵泡过早黄体化。

此外，BMP15还参与雌激素的调节。BMP15可通过下游Smad4信号，促进FSH诱导的类固醇生成关键调节因子CYP11A1的表达，从而诱导雌二醇（estradiol，E2）的产生[23]。CYP19A1是将雄烯二酮转化为E2的关键芳香化酶，是E2合成中关键的类固醇调节因子，参与FSH诱导的卵泡中E2的产生。Shimizu等[15]研究表明，BMP15可通过增加FSHR上调CYP19A1的表达，从而提高E2的水平。

4 BMP15与生殖内分泌疾病的关系

4.1 PCOSPCOS是一种涉及生殖、内分泌和代谢的终身性疾病，影响多达17%的育龄期女性，是无排卵性不孕的主要原因[24]。近年研究表明PCOS患者卵泡液中BMP15的表达降低，可能通过诱导颗粒细胞凋亡导致PCOS患者的卵泡发育不良，推测PCOS的发病与遗传和环境因素关系密切，卵泡微环境异常可能影响卵泡发育[1]。

卵泡异常闭锁尤其是早卵泡期卵泡的发育停滞是PCOS患者卵泡发育的典型特征[25]。Wei等[26]采用免疫组织化学方法分析PCOS女性与正常排卵女性卵巢组织中BMP15蛋白表达的差异，发现与正常排卵女性相比，PCOS女性卵巢组织中始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞与卵母细胞的BMP15含量显著降低，而排卵前卵泡的BMP15含量却与正常排卵女性相当，鉴于BMP15具有调节早卵泡期卵泡发育及闭锁的作用，认为BMP15表达下降可能参与介导PCOS患者早卵泡期卵泡发育不良。上调BMP15的表达可通过增加促生存因子Bcl-2、降低促凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达，防止卵泡过度凋亡，从而对PCOS患者具有潜在治疗作用[1]。

已有研究表明，BMP15的基因突变参与PCOS发病。Liu等[27]对216例中国PCOS患者进行BMP15的编码区突变分析发现，与200例生育力正常的健康对照组女性相比，PCOS患者的BMP15中显示了5个新的错义突变（c.34C＞G、c.109G＞C、c.169C＞G、c.288G＞C和c.598C＞T）。Mehdizadeh等[28]对70例伊朗PCOS患者的BMP15基因进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），基因测序发现PCOS患者BMP15基因的外显子1存在2种突变体（BMP15基因5′非编码区启动子区域中的c.-9C＞G和BMP15基因外显子编码区中的c.A308G）。因此认为BMP15与PCOS的发病密切相关，其表达下降可能通过影响早卵泡期的卵泡发育参与PCOS的发生。

4.2 POIPOI是一种女性在40岁之前出现的卵巢功能减退现象，影响1%～2%的女性。POI患者卵巢中卵子的质量与数量显著降低，临床多表现为月经稀发或闭经，伴随FSH升高和雌激素不足。POI病因复杂，可归因于自身免疫、病毒感染、遗传和医源性因素等，遗传变异在POI的发病中起关键作用[29]。BMP15作为卵泡微环境中重要的生长因子，其突变与POI的发生密切相关，其可通过调节卵泡凋亡及始基卵泡的激活改善女性卵巢储备力。

BMP15的基因突变介导POI的发生。母猪基因敲除实验表明，敲低BMP15基因可导致卵巢大小及卵泡数量显著减少，导致卵巢功能减退[30]。Di Pasquale等[31]运用PCR技术对患有卵巢功能衰竭的两姐妹进行候选基因筛查，首次报道了BMP15基因（p.Y235C）的杂合错义突变可能介导POI的发生。这种位于BMP15第2个外显子上的基因突变可导致前体蛋白的异常加工，并可能通过损害BMP15对颗粒细胞的促有丝分裂作用，导致颗粒细胞增殖减退，介导POI的发病。Rossetti等[32]认为BMP15基因前区和成熟肽中的杂合错义突变可能干扰BMP15与GDF9形成的异二聚体“cumulin”的活性，导致卵泡耗竭率增加，从而诱发POI。Afkhami等[33]采用直接测序法对24例伊朗POI妇女进行BMP15基因检测，筛选发现了新的p.N103K 和p.M184T突变，这2种突变均编码BMP15的前结构域，与继发性闭经、FSH升高和卵巢萎缩等表现密切相关。此外，还有研究揭示了POI与BMP15基因突变的相关性。Ferrarini等[34]在1例POI女性中筛选出了BMP15基因的新杂合突变c.406G＞C（V136L）。Santos等[35]发现BMP15:c.852C＞T中变异的基因型CT和TT可能是POI发生的危险因素。

卵子发生障碍、凋亡加速和始基卵泡的加速耗竭是POI发生的根本原因。颗粒细胞凋亡可导致卵母细胞赖以生存的生长因子、营养及代谢物质减少，阻滞卵母细胞发育，诱导卵母细胞凋亡。BMP15可通过抑制颗粒细胞凋亡，促进卵子发育成熟，调控卵巢储备。在哺乳动物中，始基卵泡的数量决定卵巢储备力，始基卵泡的过度激活或加速丢失可能加快原始卵泡池的耗竭，导致卵巢储备功能下降。BMP15可通过调节始基卵泡激活所需的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信号调控卵巢储备功能。此外，Park等[36]的研究表明，卵巢内BMP15的表达与女性年龄呈负相关，是预测卵巢储备功能和生殖衰老的潜在分子。因此基于BMP15与POI的相关性，BMP15有望作为临床上诊治POI的相关生物靶点。

5 结语

BMP15对卵母细胞发育成熟、颗粒细胞增殖分化、卵泡闭锁以及类固醇激素的调节具有重要的作用。BMP15的表达降低或基因突变与PCOS、POI等多种生殖内分泌疾病密切相关。然而PCOS、POI等均为多基因影响的疾病，单一靶点突变尚不能充分解释所有的临床病理改变，因此未来可采用全外显子测序等方法，以筛选BMP15与相关其他基因突变共同介导疾病发生的可能性。此外，现有的针对BMP15基因突变的临床研究存在样本量小、缺乏可重复性及通用性的问题。未来可进一步开展大样本量及多中心的随机对照研究，以明确BMP15在相关生殖疾病中的确切作用机制。总之，了解BMP15在卵泡发生过程中的作用及参与相关生殖内分泌疾病的发生机制不仅有利于促进其成为相关诊疗靶点，还能为临床上一些高危人群的遗传咨询以及生育力保存提供重要理论依据。