对奶牛布鲁菌病的监测方法探讨

胡涛

（阿拉善右旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 阿拉善 750300）

1 牛布鲁菌病概述

1.1 临床症状

该病常发地区的牛感染后一般多为慢性经过，临床上几乎看不到症状。潜伏期2周～6个月，奶牛最明显的症状是流产，可发生于妊娠母牛的任何时期，但多发于妊娠后6～8个月，多见胎衣停滞。患牛多为带菌者，奶牛产奶量下降。大多数感染母牛只流产1次，如果改善饲养管理条件，可达到自然痊愈的效果。公牛常见睾丸炎和附睾炎，急性期病牛睾丸肿痛，并可能伴有中度发热，食欲减退，精液中含有大量布鲁菌。慢性期病牛精液排菌量少，但是常呈间歇性排菌，有的牛排菌可持续数年。这类病牛还常见关节炎和滑液囊炎。

1.2 病理变化

1.2.1 剖检变化。妊娠母牛子宫与胎膜的病理变化比较突出。流产前数天阴唇及阴道黏膜充血、水肿，流出恶臭的淡红色黏液。子宫绒毛膜间隙中有污灰色或黄色恶臭胶样渗出物。绒毛膜因充血而呈紫红色，表面覆盖有黄色坏死物和污灰色脓汁，常见深浅不一的糜烂面。胎膜因水肿而肥厚，呈胶样浸润外观。由于母体胎盘与胎儿胎盘的炎症及坏死等因素，影响胎儿对营养的吸收，导致死亡，出现流产，但是胎儿胎盘与母体胎盘粘连，引起胎衣滞留。如果继发化脓菌感染，可发生化脓性子宫炎。病原菌长期潜伏，可发展为慢性子宫炎。外观子宫体积增大，黏膜肥厚，并形成波纹状皱褶，有时还可见局灶性坏死和溃疡，或有息肉状增生物形成。输卵管肿大、变粗，黏膜增厚而有弹性。卵巢初期表现为浆液-纤维性炎，其后卵巢组织硬化，有时形成卵巢囊肿。乳腺常表现为间质性乳腺炎或继发性萎缩及硬化。乳腺切面多见黄色小结节。公牛患布鲁菌病时，可发生化脓-坏死性睾丸炎、附睾炎和精囊炎。睾丸显著肿大、变硬，由于被膜粘连而不能滑动，切面下可见灰色干涸坏死和灰黄色脓性软化灶。慢性病例还可见关节炎和腱鞘炎。

1.2.2 组织学变化。显微镜下观察，可见母牛子宫绒毛膜充血、出血、水肿及炎性细胞浸润，上皮细胞变性、坏死或发生脓性崩解。渗出物中含有脱落的上皮细胞、嗜中性粒细胞、组织坏死崩解产物及大量病原菌等。子宫固有层中有弥漫性或局灶性淋巴细胞浸润，乳腺间质中有淋巴细胞和浆细胞浸润及结缔组织增生。镜检公牛可见大部分精小管发生萎缩，失去其多层结构，精原与精母细胞坏死、崩解，一些精小管内充满崩解脱落的各类精细胞，严重时失去管状结构。有的散有大量嗜中性粒细胞渗出、崩解，形成大小不等的囊肿。在囊肿周围的间质中，除有浸润的嗜中性粒细胞外，可见淋巴细胞和网状细胞增殖，有上皮样细胞结节和增生性结节。

1.3 病原学

牛种布鲁菌是奶牛布病的主要病原，在羊布病流行区偶尔也感染羊种布鲁菌，牛感染猪种布鲁菌的病例则少见。各种生物型的牛种布鲁菌对奶牛都有致病性，动物品种和性别对该病的感染没有明显区别，但是年龄和怀孕与否区别明显。一般来说，犊牛和老龄牛对该病的感受性较低，而处在青春期的牛则较易感，怀孕奶牛的感染性最高。流产是该病的主要症状，产出死胎或软弱犊牛，而且在产后排出大量病原菌，是引起畜间暴发和流行的主要根源。

成年健康牛对布鲁菌具有相对高的易感性，高于幼畜但低于孕畜。幼畜由于生殖系统还未成熟和可以通过哺乳从母畜获得抗体，所以对布鲁菌的易感性低。老龄动物一方面由于它们的生殖功能已经衰退，对布鲁菌不敏感；另一方面这些动物在其生命活动中或多或少地获得了传染后的免疫作用，所以对布鲁菌的易感性也很低。

1.4 发病机制

流产材料如胎衣、胎儿和阴道排出物等含有大量病原菌，母牛乳汁和公牛精液中也有布鲁菌存在。在自然感染情况下，布鲁菌通过消化道、呼吸道、皮肤、黏膜和生殖道进入动物体内。病菌进入牛体后先在入侵部位短时间存活，然后经淋巴管进入淋巴结。如果病菌不被机体消灭，则在淋巴中生长繁殖，然后进入血流，引起菌血症，导致体温升高。进入血流中的布鲁菌扩散到各个器官中，在停留的器官中引起病理变化。随着病理过程向慢性化发展，菌血症出现的机会减少。

2 血清布病抗体检测方法

2.1 虎红平板凝集试验（RBT）

该试验又称班氏孟加拉红平板凝集试验。由于所用的抗原是酸性（pH 3.6～3.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中IgM类抗体的凝集活性，检查出的抗体是IgG类，因此提高了该反应的特异性。该方法简便、快捷且容易操作，适用于基层大面积检疫[1]。

2.2 试管凝集试验（SAT）

该试验又称莱特凝集试验。将奶牛血清作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 4 个稀释度。 被检奶牛血清凝集价为1∶100及以上时判定为阳性；血清凝集价为1∶50时判定为可疑[2]。该方法特异性较好，敏感性也高，但试验步骤繁杂，耗时较长，不适用于基层大面积检疫，仅适用于实验室血清学确诊。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

该试验分为间接酶联免疫吸附试验 （iELISA）和竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）2种方法。该方法具有敏感、特异和快速等特点。试验用ELISA检测仪读取数值，相比试管凝集和虎红平板凝集降低了主观判断的随机性和不确定性。

3 奶样布病抗体检测方法

3.1 全乳环状试验（MRT）

3.1.1 原理。当乳汁中存在特异性布鲁菌凝集抗体时，部分抗体被乳汁中的脂肪球吸附，与加入的带色布鲁菌抗原结合出现凝集反应，由于乳脂比重小而浮在乳汁表层，因此在乳脂层中形成带色环状带，而其他部分无色。

3.1.2 试验程序。取新鲜牛乳或混合奶1 mL置于小试管内，加入1滴乳环抗原（30～50 μL）充分混匀，置于37℃温箱1 h后判定结果。

3.1.3 判定标准。①强阳性反应（＋＋＋）。乳柱上层乳脂形成明显红色环带，乳柱白色，临界分明。②阳性反应（＋＋）。乳脂层的环带呈红色，但不显著，乳柱略带颜色。③弱阳性反应（＋）。乳脂层的环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深。④疑似反应（±）。乳脂层的环带颜色不明显，与乳柱分界不清，乳柱不褪色。⑤阴性反应（-），乳柱上层没有任何变化，乳柱颜色均匀。

3.1.4 注意事项。奶牛奶样必须是新鲜全脂乳，凡腐败、变酸和冻结乳不宜作试验用。夏季的乳应于当天检测，保存于2～4℃冰箱内的乳7 d内可用；患乳腺炎及其他乳房疾患牛所产的乳以及初乳不宜作MRT，脱脂乳及煮沸过的乳也不能用[3]。

3.2 胶体金免疫层析试验（GICA）

该方法属于新型快速诊断法，也称为布鲁菌抗体快速检测卡。方法是向装有1 mL新鲜奶样的1.5 mL EP管中滴加 2滴奶样缓冲液，颠倒混匀后静置5～10 min，待析出上清，将处理后的奶样上清加入到检测孔中反应20 min，与胶体金标记的抗原一起沿层析膜移动。如果样品中存在布病抗体，则与检测线上的布病抗原结合而显色。

4 讨论

目前对奶牛布病监测主要采用血清抗体检测，用虎红平板凝集试验作为初筛试验，用试管凝集试验或竞争酶联免疫吸附试验作为血清学确诊试验。3种布病血清抗体检测方法各有优缺点：虎红平板凝集试验简单快捷成本低，但不能确诊，容易出现假阳性，而且容易因反应时间偏长造成误差；试管凝集试验步骤繁琐，溶液需要在恒温箱孵育18～24 h，结果需试验人员肉眼辨别，存在主观因素；竞争酶联免疫吸附试验方法简单，但是成本较高，对人员的专业性要求较高。最重要的是对于基层防疫员来讲，开展采集奶牛血样工作存在以下问题：一是奶牛保定较难；二是基层防疫员专业水平不高；三是频繁采血监测对奶牛产奶会造成一定影响。全乳环状试验和胶体金免疫层析试验方法简便、快捷，特异性和敏感性都较高。全乳环状试验1 h判定结果,布鲁菌抗体快速检测卡25 min左右即可判定结果。最关键的是奶样相比较血样更容易采集，这2种试验在基层大面积检疫和防疫工作中发挥了重要作用。

5 结论

要查明一个地区的牛群，特别是要确定哪一个牛群有布病存在，最有效和最准确的方法是取牛群的混合乳做全乳环状试验或胶体金免疫层析试验。每个牛群的混合乳可以在收奶站或牛奶加工厂收集，也可以在混合乳浆罐运走之前收集。通过检测混合乳，确定哪一个牛群有布病后，再用血清凝集试验法逐头检查全场牛，了解布病在该场的流行情况。用这两种方法检查一个地区的牛群布病，比单独采用血检方法逐头检查该地区的全部牛群更高效便捷。