抗氧化剂改善卵母细胞线粒体功能和不孕女性生育结局的研究进展

武硕，焦立媛，侯海燕

线粒体是细胞的能量工厂，通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），通过5种酶复合物形成电子传递链（electron transfer chain，ETC），并在ATP合酶的控制下产生电化学质子梯度，将二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）磷酸化为ATP[1]。线粒体呼吸是有氧代谢的一种形式，氧是线粒体ETC的最终电子受体。单电子与氧或其他电子受体反应产生的自由基称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），生理水平的ROS是细胞正常功能所必需的。然而ROS产生过多会启动细胞凋亡过程，破坏细胞的基本功能。线粒体是机体抗氧化的第一道防线，其在维持氧化和抗氧化的平衡中发挥重要作用[2]。线粒体功能障碍（mitochondrial dysfunction）可能影响卵母细胞的质量、胚胎发育和妊娠结局，甚至增加子代远期心血管疾病的发生风险[3]。

1 线粒体与细胞氧化损伤

氧化应激可以由线粒体功能障碍引起，也可以是导致线粒体功能障碍的原因。首先，氧化应激可影响细胞膜的完整性。其次，氧化应激可促进线粒体ETC酶的失活，增加线粒体DNA的突变，干扰细胞内线粒体的功能。由于线粒体DNA缺乏组蛋白的保护，且非常接近线粒体内膜，因此很容易发生突变。最后，氧化应激也与端粒的缩短和衰老有关。

氧化应激和线粒体功能障碍都是由内在和外在因素共同作用导致的。内在因素包括年龄、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）和早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）。外在因素包括诱导ROS产生的环境暴露，如饮食、职业暴露和辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）治疗。研究表明ART过程中体外干预引起氧化应激的风险要显著高于体内受孕过程。尽管ART技术不断取得新进展，但是体外受精（in vitro fertilization，IVF）仍然无法重建自然受精的环境条件。氧浓度、温度变化、高光照、培养基的成分和冷冻保存介质是IVF实验室氧化应激的环境来源，这意味着IVF过程中需要补充抗氧化剂。

2 抗氧化剂与生殖

目前已有研究表明抗氧化剂治疗对不孕症门诊患者的活产率和临床妊娠率有积极影响，但为低质量的证据[4]。抗氧化剂可在ART治疗前口服补充或在ART过程中加入培养基中。口服抗氧化剂可能会提高配子的质量，在培养基中加入抗氧化剂可以改善体外成熟（in vitro maturation，IVM）的过程，减少IVF过程中ROS的产生。改善线粒体功能是抗氧化剂提高配子质量的重要机制，虽然在许多其他疾病中，应用抗氧化剂可以显著改善线粒体的功能，但是其对人类卵母细胞的作用仍未得到证实。

2.1 辅酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）CoQ10在线粒体呼吸链中参与ATP的合成，其还原形式泛醌通过回收维生素E保护生物膜免受脂质过氧化。

动物研究发现，排卵前补充CoQ10可提高老龄小鼠的线粒体功能[5]。此外，在培养基中加入CoQ10可以逆转小鼠和猪模型中年龄相关的卵母细胞质量减退[6]。将CoQ10注射到老龄小鼠体内，可以增加卵丘细胞中线粒体的呼吸活动和葡萄糖摄取，从而提高其生育力[7]。这些发现均表明，补充CoQ10不仅对卵母细胞有益，而且对卵丘细胞也有益。

人体研究表明，血浆CoQ10水平随着年龄的增长而下降，补充CoQ10可能通过改善线粒体功能从而改善不孕症患者的妊娠结局。衰老会导致人类卵丘细胞中CoQ10合成基因的表达减少，因此补充CoQ10可能缓解衰老[7]。卵泡液中CoQ10的水平与胚胎质量和妊娠率有关。补充CoQ10可提高不孕症患者卵泡液中CoQ10的水平[8]，但对临床结局的改善尚无定论。高龄（35～43岁）不孕女性补充CoQ10（600 mg/d，持续2个月，直至取卵当天）后胚胎非整倍体率没有显著变化（CoQ10组46.5%vs.对照组62.8%），这表明补充CoQ10并不能减少ROS长期暴露对减数分裂的影响[9]。该研究中CoQ10的干预剂量和持续时间是参考小鼠的研究，而人类也许需要更长的治疗时间或更高的剂量才能得到显著的效果。有研究表明，补充CoQ10（卵巢刺激前2个月600 mg/d）可以提高卵巢储备功能减退的年轻女性的卵巢反应性，并提高受精率，增加优质胚胎数量，但是在临床妊娠率、流产率和活产率方面未见明显改善[10]。2020年Florou等[11]的一项系统评价和Meta分析显示，与安慰剂或空白对照组相比，干预组（IVF前口服CoQ10）的临床妊娠率显著增加（干预组28.8% vs.对照组14.1%，OR=2.44，95%CI：1.30～4.59，P=0.006），但是2组的活产率（干预组28% vs.对照组17.4%，OR=1.67，95%CI：0.66～4.25，P=0.28）和流产率（干预组10%vs.对照组13.6%，OR=0.61，95%CI：0.13～2.81，P=0.52）差异无统计学意义。可能与纳入研究的人群基本特征、CoQ10的治疗剂量和疗程存在高度的异质性有关。此外，补充CoQ10对排卵障碍和PCOS患者也有益处。一项随机对照试验显示，对枸橼酸氯米芬（clomiphene citrate，CC）耐药的PCOS患者在CC治疗过程中加入CoQ10作为辅助用药后，直径≥14 mm的卵泡数量显著增多[12]。

IVM过程中，CoQ10通过改善未成熟卵母细胞线粒体的功能而改善IVM结局。2020年Ma等[13]研究指出，高龄女性补充CoQ10后，其IVM过程中卵母细胞的成熟度显著提高（82.6%vs.63.0%，P=0.035），而减数分裂后非整倍体率显著下降（36.8%vs.65.5%，P=0.020），然而在年轻女性中没有发现相似效果。但是，从卵母细胞受精到胚胎发育至囊胚期，在培养基中加入米托喹啉（CoQ10类似物）并不能改善高龄女性的胚胎质量。与空白对照组相比，培养基中添加米托喹啉组第5天高质量囊胚率（18%vs.20%）、总体高质量囊胚率（48%vs.45%）、总体囊胚形成率（63%vs.62%）和整倍体率（33%vs.30%）差异无统计学意义[14]。尽管CoQ10是非处方药物、廉价且安全，但是由于其对人类生育力的影响仍需要更好的临床试验设计、纳入更多的患者来全面衡量和证实，因此目前在临床上并没有得到广泛应用。

2.2 白藜芦醇白黎芦醇是一种天然的多酚化合物，来源于葡萄、红酒、花生和几种药用植物。因其抗衰老、抗氧化、抗炎、胰岛素增敏、心脏保护、血管扩张和抗肿瘤等特性成为许多疾病的辅助用药。

在大鼠实验中，补充白藜芦醇可抑制卵泡闭锁，增加卵泡储备，延长卵巢寿命[15]。小鼠实验发现，经白藜芦醇治疗12个月后，治疗组与对照组相比有更多的卵泡，结合纺锤体形态和染色体的排列证实了卵母细胞的数量和质量都得到了改善；补充白藜芦醇的小鼠卵巢中端粒酶的活性、端粒酶的长度和年龄相关的基因表达与年轻小鼠相似[16]。白藜芦醇可通过抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路改善POI患者的卵巢功能障碍，通过抑制NF-κB信号传导抑制颗粒细胞凋亡。有研究表明，白藜芦醇可抑制POI大鼠氧化应激和炎症反应[17]，通过抗凋亡作用防止POI小鼠卵原干细胞丢失[18]。

在生殖领域，白藜芦醇可能对卵巢储备功能减退、PCOS、子宫内膜异位症和子宫肌瘤的患者有益。白藜芦醇可通过激活Sirtuin1（SIRT1）调节线粒体生物发生和自噬之间的平衡，从而增强卵母细胞和颗粒细胞中线粒体内稳态，刺激线粒体生物合成，改善高龄女性的卵巢储备功能。与未添加白藜芦醇组相比，在IVM培养基中加入白藜芦醇后24 h（55.26%vs.37.84%）和36 h（71.05%vs.51.35%），高龄女性未成熟卵母细胞的成熟率显著提高（P＜0.05）；与未添加白藜芦醇组相比，添加白藜芦醇36 h后纺锤体形态异常率（68.5%vs.89.3%）和染色体排列不规则的卵母细胞比例（69.1%vs.88.0%）显著降低（P＜0.05），线粒体免疫荧光强度显著提高（53.0% vs.31.1%，P＜0.05），这均证明了白藜芦醇可以提高卵母细胞的质量[19]。无论是IVM还是传统的IVF，补充白藜芦醇可以减少ROS的产生，增加ATP的含量，从而改善卵母细胞的成熟度和胚胎的发育潜能。

但是，白藜芦醇对不同细胞产生的作用也不同，与颗粒细胞相反，白藜芦醇对卵泡膜细胞具有促凋亡作用，通过抑制雄激素生物合成途径中的限速酶来减少卵泡膜间质细胞中雄激素的产生。临床研究表明，PCOS患者口服白藜芦醇（1 500 mg/d）后雄激素水平显著降低[20]。一项随机三盲对照试验显示，与未服用白藜芦醇的PCOS患者相比，每日服用800 mg白藜芦醇的PCOS患者高质量卵母细胞率（81.9%vs.69.1%，P=0.002）和受精率均显著增加（89.8% vs.78.8%，P=0.024）[21]。白藜芦醇还能降低血管内皮生长因子的表达，从而改善卵巢过度刺激综合征的症状，抑制异位子宫内膜的生长，但是其抗炎特性可能会抑制蜕膜化的炎症反应，导致子宫内膜容受性降低，对着床和子宫内膜蜕膜化产生不利影响。一项回顾性研究评估了白藜芦醇（200 mg/d）对新鲜和冻融胚胎移植周期妊娠结局的影响，校正可能的混杂因素后，多元Logistic回归分析显示，与未服用白藜芦醇的患者相比，服用白藜芦醇的患者临床妊娠率降低且流产率升高，即使移植了高质量的胚胎妊娠结局也很差，这可能与白藜芦醇对子宫内膜蜕膜化的抑制作用有关[22]。白藜芦醇的半衰期为3～9 h，如果在排卵当日停止摄入白藜芦醇或行全胚冷冻，则很可能不会影响胚胎着床或妊娠。过量服用白藜芦醇可能会产生头痛、恶心、腹泻、头晕和肝功能不全等不良反应，且目前尚缺乏胚胎-胎儿毒性的数据，因此不建议大剂量服用，妊娠期应停止补充。

2.3 褪黑素褪黑素是在松果体内由色氨酸合成的，其仅在夜间分泌，并以昼夜节律的方式被释放入血，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎和抗雄激素的特性[23]。褪黑素可以调节下丘脑-垂体-性腺轴，减少卵泡内的氧化应激。在动物研究中，无论是IVM还是IVF，在培养基中添加褪黑素均可改善生育结局。褪黑素治疗12个月后，老龄小鼠卵母细胞质量和数量均增加且产仔数增加，提示褪黑素可能延缓卵巢衰老。褪黑素可以显著增加IVF周期的获卵数（11.5±6.3 vs.6.9±3.8，P=0.000 1）、成熟卵母细胞数（9.0±5.6 vs.4.4±3.3，P=0.000 1）[24]和MⅡ卵率（81.9%vs.75.8%，P=0.034）[25]。对于前次IVF受精率较低（＜50%）的不孕女性，经褪黑素治疗后的IVF周期受精率较前一周期显著增加（褪黑素组增加29.8%vs.未使用褪黑素组增加1.9%，P＜0.01）[26]。

临床研究表明，褪黑素可以改善PCOS、子宫内膜异位症和其他妇科疾病患者的生育结局，且有助于纠正月经紊乱及痛经等。褪黑素可以通过胎盘屏障，因此妊娠期间补充褪黑素可保护胎儿免受氧化应激。在IVM过程中，PCOS患者的未成熟卵母细胞经褪黑素处理后体外成熟率有所提高。然而，另一项随机对照试验发现，褪黑素对获卵数、MⅡ卵数、受精率、胚胎质量、临床妊娠率和活产率并没有改善作用[27]。卵巢中褪黑素的分泌随着年龄的增加而减少，卵泡液中褪黑素的水平可以作为IVF结局和卵巢储备功能的预测因子[28]。Espino等[29]发现，与生育力正常的女性相比，不明原因性不孕患者卵泡液中褪黑素水平相对较低，在卵巢刺激期间补充褪黑素至取卵日（其中一组剂量为3 mg/d，另一组为6 mg/d）较对照组有更多的MⅡ卵和可移植胚胎。Takasaki等[30]发现从上一个月经周期开始服用褪黑素3 mg/d直到扳机日，卵泡液中的褪黑素水平升高，而脂质过氧化物水平降低，提示褪黑素对卵母细胞和颗粒细胞具有抗氧化作用，可以提高卵母细胞质量，增加可移植胚胎数和ART的成功率。目前临床上褪黑素经常被用于睡眠的辅助治疗，而且相对安全。但是迄今为止关于褪黑素与生育力方面的研究均为短期疗效，长期的临床研究还有待进一步开展。

2.4 维生素目前尚无临床试验从抗氧化方面评估维生素在改善卵母细胞和胚胎质量中的作用。

2.4.1 维生素A在生殖领域，维生素A及其代谢物在卵泡生长、类固醇合成、卵母细胞成熟和胚胎发育中起重要作用。体外研究发现，在IVM培养基中添加维生素A可增强线粒体膜电位，降低ROS水平，减少细胞凋亡，从而提高卵母细胞成熟率[31]。但是尚不清楚其抗氧化特性是否也在这些过程中发挥作用。

2.4.2 叶酸在细胞水平上，叶酸作为甲基供体，将同型半胱氨酸甲基化合成甲硫氨酸。甲硫氨酸是产生谷胱甘肽（细胞内主要的抗氧化剂）的关键介质，叶酸缺乏将导致同型半胱氨酸蓄积或高同型半胱氨酸血症，从而造成氧化应激和细胞抗氧化能力降低，导致不良妊娠结局的发生。卵泡液中同型半胱氨酸水平与卵母细胞成熟度及IVF第3天胚胎的质量呈负相关，而叶酸摄入量与种植率、临床妊娠率和活产率呈正相关。动物模型中，孕前叶酸缺乏将影响雌性的生育力及胎儿的生存能力，例如可能抑制大鼠的排卵[32]以及增加恒河猴退化卵泡的数量[33]，而排卵前补充叶酸可降低小鼠胚胎发育迟缓的比例[34]，增加大鼠卵母细胞中谷胱甘肽的合成，这表明叶酸在卵泡发生中发挥重要作用。临床上叶酸缺乏的女性在IVF过程中常出现卵巢反应不良、卵母细胞质量下降和妊娠率降低。叶酸对卵泡发育和早期胚胎发育有重要影响，但是尚缺乏临床试验来证实其作为抗氧化剂在不孕症治疗和提高卵母细胞线粒体功能中的优势。

2.4.3 维生素C也称抗坏血酸，是一种强抗氧化剂。动物实验表明，将维生素C加入培养基中可以调节与线粒体氧化还原有关的一些关键基因，如提高猪冷冻胚胎的质量和存活率[35]。但是临床研究尚未发现补充维生素C对人卵母细胞成熟、受精和胚胎发育参数有显著影响[36]。

2.4.4 维生素D维生素D缺乏可能会影响生殖功能，但仍缺乏证据。一项评估补充维生素D对卵母细胞质量影响的随机对照试验正在进行中，该研究收集了IVF助孕患者的卵泡液和卵丘细胞样本，研究的主要结局指标是临床妊娠率[37]。由于维生素D具有抗氧化特性和改善其他组织线粒体功能的作用，因此其可能会改善卵母细胞质量，未来仍需进一步的研究来证实。

2.4.5 维生素E维生素E的主要作用是在脂质过氧化反应中保护细胞膜免受氧化损伤。添加了维生素E的培养基可以提高牛的囊胚形成率[38]。在小鼠模型中也发现了相似的结果，补充维生素C和E可以延缓小鼠卵巢老化。Bahadori等[39]发现卵泡液中的维生素E水平为0.35～1 mg/dL（1 mg/dL=23.2 μmol/L）、1～1.5 mg/dL、1.5～2 mg/dL和2～7.4 mg/dL时，卵母细胞的成熟率分别为89.2%、69.6%、84.9%和76.7%（P=0.002），其中0.35～1 mg/dL和1.5～2 mg/dL 2种浓度卵母细胞的成熟率较高；血清维生素E水平为5 mg/dL、5～10 mg/dL、10～15 mg/dL和15～20 mg/dL时优质胚胎率分别为46.2%、54.9%、87.5%和42.9%（P=0.007），其中血清维生素E水平为10～15 mg/dL时优质胚胎率较高。最近的一项随机对照试验显示，与未补充任何维生素的PCOS患者相比，同时服用维生素E和维生素D的PCOS患者有较高的种植率（35.1% vs.8.6%，P＜0.001）、妊娠率（69.0% vs.25.8%，P＜0.001）和临床妊娠率（62.1%vs.22.6%，P=0.002）[40]。然而，这些结果与抗氧化机制无关。

2.5 其他抗氧化剂还有许多分子具有抗氧化特性，如生长激素、孕酮和姜黄素，但是只有生长激素的作用机制与线粒体活性的改善有关[41]。此外，高龄女性颗粒细胞在围排卵期腐胺缺乏，补充腐胺可改善老龄小鼠的卵母细胞质量，并与线粒体功能的改善有关[42]。因此腐胺可能是一种恢复卵巢功能的新疗法。另一种抗氧化方法是热量限制（caloric restriction，CR），即将日常饮食限制在正常饮食的25%～50%。CR可以延长啮齿动物的寿命，延缓卵巢衰老，提高生育力并延长生殖寿命[43]。然而，在实际生活中CR的实施并不容易，但有可替代的物质产生同样的效果[44]，如二甲双胍，它可抑制线粒体ETC复合物Ⅰ而减少肝脏葡萄糖的产生，这一过程模拟了CR的效应，减少了ROS的产生。

3 结语与展望

线粒体在卵母细胞成熟、受精和胚胎发育中发挥关键作用。外源性天然抗氧化剂，如白黎芦醇、CoQ10、褪黑素、叶酸和维生素等，可通过增强线粒体功能或直接清除ROS来保护卵母细胞和胚胎免受氧化应激损伤。在ART治疗中，通过口服或在IVF培养基中添加抗氧化剂可提高卵母细胞质量并改善助孕结局。未来应探讨抗氧化剂对特定线粒体参数的影响，如线粒体膜电位、形态和分布等。抗氧化疗法是一种很有前途且安全的治疗方法，未来需要更高质量的临床试验来明确适用人群、作用机制和给药方案，并评估其近期和远期的安全性。